白僵蚕不同浓度乙醇提取物的体外抗氧化作用研究＊

周心晨，但彩云，崔诗遥，李文乐，刘 雪，李聪慧，时连根

（浙江大学 动物科学学院，浙江 杭州 310058）

白僵蚕（Bombyx batryticatus）是蚕蛾科家蚕（Bombyx mori）幼虫感染白僵菌（Beauveria bassiana（Bals.）Vuill）后致死的干燥菌虫复合体，也称僵虫、天虫、姜虫等，始载于《神农本草经》，是我国一味传统的珍贵中药材［1～3］，其用药标准收载于《中国药典》2020年版一部［4～15］。白僵蚕有息风止痉、祛风止痛、化痰散结等功效，临床用于治疗肝风夹痰、惊痫抽搐、小儿急惊风、破伤风、中风口、风热头痛、目赤咽痛、风疹瘙痒、发颐痄腮等疾病。现代药理学研究证实，白僵蚕富含黄酮类、白僵菌素、多糖类等多种活性成分，具有抗惊厥、抗凝血、抑菌、抗肿瘤、降糖降脂、抗氧化等作用。白僵蚕的抗氧化作用是当前研究热点之一，国内外学者报道了白僵蚕抗氧化成分提取的多种技术工艺［16，17］，但对提取溶剂浓度影响提取物的抗氧化缺乏研究，这阻碍了白僵蚕抗氧化功能的开发利用。本文用不同浓度乙醇对白僵蚕进行回流提取，通过抗DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基、抗羟基（·OH）自由基和总还原力试验，比较白僵蚕不同浓度乙醇提取物的体外抗氧化作用。

1 材料与方法

1.1 供试白僵蚕粉及主要试剂和仪器

取5龄起蚕，均匀喷洒浓度为1.0×105分生孢子/mL的家蚕病原白僵菌分生孢子液，于25℃、90%湿度条件下饲养48 h后，于常规条件下饲养，4 d～5 d后蚕陆续发病僵死，收集僵死蚕于25℃、90%湿度条件下培养，直至蚕体覆满白色的白僵菌分生孢子，收集白僵蚕并于35℃烘箱中烘干，中药粉碎机粉碎后过100目筛，制成白僵蚕粉，-20℃冰箱保存备用。

DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精密实验设备有限公司）；METTLER TOLEDO AB104-N天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；恒温恒湿培养箱（Safe公司）；电热恒温水浴锅（上海医疗器械股份有限公司医疗器械五厂）；YQ-1002C型超声波清洗仪（上海易净超声波仪器有限公司）；Free zone 6 plus冷冻干燥器（Labconco公司）；RE52CS旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；UV2450紫外分光光度仪（日本岛津公司）。

无水乙醇、抗坏血酸（VC）、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、七水合硫酸亚铁、双氧水（H2O2）、水杨酸等化学试剂均为分析纯，购自中国医药上海化学试剂公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）为Sigma公司产品。

1.2 白僵蚕不同浓度乙醇提取物的制备

采用超声波辅助乙醇回流提取法。称取三份等质量白僵蚕粉末，按1∶10的料液比（质量体积比，g/mL），分别缓慢加入体积分数为65%、80%和95%的乙醇，混匀后，在常温下用超声波清洗仪超声（功率60%、频率53 kHz）处理30 min，然后于60℃水浴锅中回流提取2 h；收集提取液，抽滤，滤液置旋转蒸发仪减压浓缩，得到白僵蚕不同浓度乙醇提取浓缩液；将浓缩液入冷冻管并封口，置于-80℃冰箱过夜保存；取出冷冻管，快速置于冷冻干燥机中于-50℃下真空干燥，得到白僵蚕65%、80%、95%乙醇提取物。

1.3 DPPH自由基清除试验

参考胡碧君报道的方法［18］。取白僵蚕不同浓度乙醇提取物，分别用双蒸馏水溶解并配制系列浓度样品液；取样品液2 mL，加入等体积的0.04 mg/mL DPPH溶液（用提取时相对应浓度乙醇配制）（Ai），并设加入等体积的提取时相对应浓度乙醇液替换DPPH溶液（Aj），混匀后在室温下遮光反应30 min；取上清液在波长517 nm下测定吸光度，试验重复三次，设置抗坏血酸为阳性对照组，双蒸馏水替换样品液为空白对照组（A0）。按下列公式计算DPPH清除率（SE）：

式中：SE为清除率；Ai为2 mL DPPH+2 mL样品液的吸光值；Aj为2 mL相对应浓度乙醇+2 mL样品液的吸光值；A0为2 mL DPPH溶液+2 mL双蒸馏水的吸光值。

1.4 羟基自由基清除试验

参考胡碧君报道的方法［18］。取白僵蚕不同浓度乙醇提取物，分别用双蒸馏水溶解并配制系列浓度样品液；取样品液1 mL，依次加入6 mmol/L FeSO4溶液1 mL、6 mmol/L H2O2溶液1 mL，混匀后静置10 min；加入6 mmol/L水杨酸溶液（显色剂）1 mL（Ai），并设加入1 mL双蒸馏水替换水杨酸溶液（Aj），混匀后37℃水浴锅中反应30 min；取上清液在波长510 nm下测定吸光度，试验重复三次，设置抗坏血酸为阳性对照组，双蒸馏水替换样品液为空白对照组（A0）。按下列公式计算清除率（SE）：

式中：SE为羟基自由基清除率；Ai为样品液+FeSO4+H2O2+水杨酸的吸光值；Aj为样品液+Fe⁃SO4+H2O2+双蒸馏水的吸光值；A0为双蒸馏水+Fe⁃SO4+H2O2+水杨酸的吸光值。

1.5 还原能力测定

参考范金波等报道的方法［19］。取白僵蚕不同浓度乙醇提取物，分别用双蒸馏水溶解并配制系列浓度样品液；依次向离心管中加入0.75 mL磷酸盐缓冲液（pH 6.6）、样品液0.75 mL、1%铁氰化钾溶液0.75 mL，混匀后于50℃水浴锅中反应20 min；取出离心管，加入10%三氯乙酸溶液0.75 mL，混匀后于室温下3000 rpm离心10 min；取上清液1.5 mL入试管中，再加入双蒸馏水1.5 mL和0.1% FeCl3溶液0.1 mL，在波长700 nm下测定吸光度，吸光度越高代表样品还原能力越强，试验重复三次。

1.6 数据统计分析

采用Excel和SPSSAU v21.0对试验数据进行统计分析，处理间差异采用LSD（Least Significant Dif⁃ference）法比较，P＜0.05表示差异达显著水平，P＜0.01表示差异达极显著水平。

2 结果与分析

2.1 白僵蚕不同浓度乙醇提取物对DPPH自由基清除活性的比较

测定白僵蚕65%、80%、95%乙醇提取物对DPPH自由基的清除率，结果如图1所示。图1显示，白僵蚕65%、80%、95%乙醇提取物在浓度0～0.2 mg/mL时，对DPPH自由基的清除率均是随着浓度提高而逐渐增大，并且均表现出较好的正相关关系；在低浓度时，白僵蚕65%、80%、95%乙醇提物对DPPH自由基的清除率显著低于VC，但随着浓度的升高，VC对DPPH自由基的清除率趋于稳定，使白僵蚕65%、80%、95%乙醇提物与VC的清除率差距逐渐缩小。通过SPSSAU v21.0计算得到，白僵蚕65%乙醇提取物对DPPH自由基的清除率-浓度曲线公式为y=277.994x+48.757，其半抑制浓度IC50为4.471 μg/mL；白僵蚕80%乙醇提取物对DPPH自由基的清除率-浓度曲线公式为y=279.326x+48.906，其半抑制浓度IC50为3.916 μg/mL；白僵蚕95%乙醇提取物对DPPH自由基的清除率-浓度曲线公式为y=157.757x+46.419，其半抑制浓度 IC50为 22.7 μg/mL。结果表明，白僵蚕65%、80%、95%乙醇提取物对DPPH自由基均表现出较强的清除作用，其清除活性为白僵蚕80%乙醇提取物＞白僵蚕65%乙醇提取物＞白僵蚕95%乙醇提取物。

图1 白僵蚕不同浓度乙醇提取物对DPPH自由基的清除活性Fig 1 Scavenging Effect of Extracts from Bombyx Batryticatus by different Concentrations Ethanol to Dpph Radicals

2.2 白僵蚕不同浓度乙醇提取物对羟基自由基的清除活性比较

检测白僵蚕65%、80%、95%乙醇提取物对羟基自由基（·OH）的清除作用，结果如图2所示。图2显示，白僵蚕65%、80%、95%乙醇提取物浓度在0～0.2 mg/mL范围内，其对羟基自由基的清除率均随浓度增大而升高，浓度与清除率间均表现出良好的量效关系；在低浓度时，白僵蚕65%、80%、95%乙醇提取物对羟基自由基的清除率与抗坏血酸对照组的差距均较大，但随着浓度的增大，其间的差距逐渐缩小。通过SPSSAU v21.0计算得到，白僵蚕65%乙醇提取物的清除率-浓度曲线公式为y=16.251x+80.475，白僵蚕80%乙醇提取物的清除率-浓度曲线公式为y=13.864x+70.829，白僵蚕95%乙醇提取物的清除率-浓度曲线公式为y=53.197x+40.021，抗坏血酸的清除率-浓度曲线公式为y=14.296x+88.934。以抗坏血酸0.1 mg/mL时的清除率90.48%为参考量，根据以上公式计算可得：1 g白僵蚕65%乙醇提取物清除羟基自由基的能力相当于162.43 mg抗坏血酸，1 g白僵蚕80%乙醇提取物清除羟基自由基的能力相当于70.55 mg抗坏血酸，1 g白僵蚕95%乙醇提取物清除羟基自由基的能力相当于105.43 mg抗坏血酸。结果表明，白僵蚕65%、80%、95%乙醇提取物对羟基自由基均表现出较强的清除作用，其中白僵蚕65%乙醇提取物的清除活性最强，白僵蚕95%乙醇提取物清除活性次之，白僵蚕80%乙醇提取物的清除活性最弱。

图2 白僵蚕不同浓度乙醇提取物对羟基自由基的清除活性Fig 2 Scavenging Effect of Extracts from Bombyx Batryticatus by different Concentrations Ethanol to Hydroxyl Radicals

2.3 白僵蚕不同浓度乙醇提取物的还原能力比较

检测白僵蚕65%、80%、95%乙醇提取物的总还原力，结果白僵蚕65%、80%、95%乙醇提取物浓度在0～0.6 mg/mL范围时，其吸光值均随浓度增大而稳步上升，并且浓度与吸光值间均表现出显著的正相关系（相关系数R2均大于0.995）。通过SPSSAU v21.0计算得到，白僵蚕65%乙醇提取物的OD值-浓度曲线公式为y=0.491x，白僵蚕80%乙醇提取物的OD值-浓度曲线公式为y=0.496x-0.002，白僵蚕95%乙醇提取物的OD值-浓度曲线公式为y=0.231x+0.001，抗坏血酸对照组的线性回归公式为：y=6.638x+0.111（R2=0.973）。以抗坏血酸的吸光值1.0为参考量，根据以上公式计算可得：1 g白僵蚕65%乙醇提取物的总还原力（OD值）相当于65.76 mg抗坏血酸，1 g白僵蚕80%乙醇提取物的总还原力（OD值）相当于66.29 mg抗坏血酸，1 g白僵蚕95%乙醇提取物的总还原力（OD值）相当于30.97 mg抗坏血酸。结果表明，白僵蚕65%、80%、95%乙醇提取物均具有较强的还原能力，其总还原力为白僵蚕80%乙醇提取物＞白僵蚕65%乙醇提取物＞白僵蚕95%乙醇提取物。

3 讨论

DPPH含有3个共振苯环，是一种较为稳定且难以清除的自由基，它的单电子在517 nm处有较强吸收峰。DPPH自由基的乙醇溶液呈紫色，与抗氧化剂反应后，其单电子将接受一个电子或者与氢原子配对而形成稳定的DPPH-H化合物，使乙醇溶液从原本的紫色转化为黄色［20］。DPPH凭借这一高灵敏特性，常被用于定量检测样品的抗氧化性。羟基自由基（·OH）是最强大的活性氧化物之一，本身携带未配对电子，可通过无选择性地抢夺其他分子的电子来产生一系列的自由基反应，能够清除羟基自由基，是抗氧化剂抗氧化力强的有效证明。因此，羟基自由基也常被用于抗氧化试验［21］。高价铁离子是为大家所熟知的氧化剂，二价铁离子在空气中暴露一段时间就会转化为三价铁离子，由此采用铁氰化钾法可测定抗氧化剂的总还原能力［19］。

图3 白僵蚕不同浓度乙醇提取物的还原能力Fig 3 Reduction Ability of Extracts from Bombyx Batryticatus by different Concentrations ethanol

本试验通过提取制备白僵蚕65%、80%、95%乙醇提取物，并分别检测其对DPPH自由基和羟基自由基的清除活性以及还原能力，来评价白僵蚕不同浓度乙醇提取物的体外抗氧化作用。研究结果显示，白僵蚕65%、80%、95%乙醇提取物均具有较好的DPPH自由基清除活性、羟基自由基清除活性和还原能力，其清除率、吸光度与提取物浓度均呈现出良好的量效关系，表现出良好的体外抗氧化作用。在65%、80%、95%三个乙醇提取浓度中，白僵蚕80%乙醇提取物对DPPH自由基的清除能力最强，其IC50值为3.916 μg/mL；白僵蚕80%乙醇提取物的还原能力也最强，其AEAC值为66.29 mgVC/g；白僵蚕65%乙醇提取物对羟基自由基的清除能力最强，其AEAC值为162.43 mgVC/g。综合来看，白僵蚕80%乙醇提取物的体外抗氧化作用更好。

蒋学采用CCD响应面方法，初步确认了80%乙醇是提取白僵蚕中黄酮类和多糖类化合物的最佳提取溶剂浓度［6］。本研究发现，白僵蚕80%乙醇提取物具有更优的体外抗氧化活性，与蒋学研究结果相一致。本研究结果为建立白僵蚕抗氧化成分提取的最佳技术工艺提供理论依据，也促进了白僵蚕抗氧化相关产品的开发。