酶联免疫吸附技术在饲料及食品安全检测中的应用

史艳艳

（天津市农业生态环境监测与农产品质量检测中心 300402）

酶联免疫吸附技术（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是基于抗原抗体反应的一种新型、快速的免疫测定技术。由于ELISA 检测技术的灵敏度高、特异性强、选择性好、实用性强，且不需要大型仪器设备，对工作人员的专业技能要求不高，被广泛应用于分析化学、生物药学、临床医学和食品安全等领域的检测。ELISA 检测技术不仅可以对饲料和食品中的药物残留、有害微生物和生物毒素等物质进行定性和定量分析，还能应用于转基因食品的安全检查，为饲料及食品安全提供参考依据。

1 酶联免疫吸附技术概述

1.1 技术原理

ELISA 是基于抗原-抗体的特异性结合反应建立起来的一种快速检测技术，即首先通过固相状态的载体吸附已知的抗原或抗体，待测样本中对应的抗体或抗原与之结合形成特异性的抗原抗体复合物，通过洗涤的方法区分固相载体上的抗原抗体复合物和其他物质，再加入酶标记的抗原或抗体，也会出现抗原和抗体特异性结合反应结合在固相载体上，加入酶反应的底物后，底物由酶催化为带颜色的产物（颜色变化为定性检测），通过吸光度值计算待测样本的抗原（或抗体）量。由于产物的量与标本中受检物质的量直接相关，ELISA 还可以进行定量分析。

1.2 试验类型

ELISA 检测技术根据待检物质类型和检测条件主要分为间接法、竞争法和夹心法。间接法主要应用于抗体检测，即将已知抗原和固相载体结合，加入待检样本，其特异性抗体和固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤后固相载体上只留下特异性抗体，再加入酶标抗抗体与其结合，间接对抗体标记上酶，加入酶的底物进行显色即可。抗原程度的高低直接影响间接法的特异性。竞争法主要用于小分子抗原的检测，即待检样本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合，若待检样本中的抗体含量多，其结合在固相上的酶标抗体会减少，因此，阴性反应颜色比阳性反应颜色更深更明显。夹心法主要用于大分子抗原检测，即通过固相抗体去检测待检样本中的抗原，该方法更适合测定二价或二价以上的分子，可以形成两位点夹心。

1.3 试验优缺点

（1）优点：ELISA 检测技术既可以检测抗原，也可以检测抗体，其反应特异性高、灵敏度强、试验操作简单、耗时短，不需要大型仪器设备，结果可读性高，分析简单且成本低，是当下较为理想的饲料和食品安全检测技术之一。

（2）缺点：ELISA 检测技术对试剂的选择性高，对相对分子量小的化合物检测难度大，且结构相似的化合物还会出现不同程度的交叉反应，因此，未来需要从单克隆抗体研发入手，加速不同检测ELISA 试剂盒的开发，更好地普及和推广ELISA检测技术。

2 酶联免疫吸附技术在饲料及食品安全检测中的应用

2.1 农药残留的检测

农药残留是威胁饲料和食品安全的重要因素之一，还会降低我国副产品的出口率，目前农业残留种类主要包括有机磷、有机氯和拟除虫菊酯类等，有机磷农药杀虫范围广，应用范围大，对人畜的危害性较高，高效液相色谱法、气相色谱法和薄层层析法检测有机磷农药残留，样品处理操作负责，而ELISA检测技术。邢玮玮和陈燕敏（2018）通过ELISA 技术测定食品中有机磷农药残留，同时对比气相色谱法和高效液相色谱法，结果发现ELISA 测定结果的可靠性更高，且操作更为方便[1]。

2.2 违禁药物的检测

盐酸克伦特罗（CL）是一种肾上腺类神经兴奋剂，CL 非兽药也非饲料添加剂，常用于支气管哮喘的治疗；莱克多巴胺（RAC）是一种人工合成的克仑巴安β 肾上腺受体激动剂，常用于治疗充血性心力衰竭症。但CL 和RAC 人畜食用后会产生副作用，我国境内分别于2002 年9 月和2011 年12 月在饲料和饮用水中食用。但仍有部分养殖户私用“瘦肉精”来抑制脂肪的合成，提高动物产品瘦肉率。贺健强等（2019）用ELISA试剂盒和液相色谱串联质谱法（LC-MSMS）同时测定动物饲料中的CL 和RAC，结果发现，饲料样品残留量在0.1ug/kg 水平以上时，ELISA 检测方法是一种快速筛查方法，且定性和定量结果可以作为初步快速筛查依据，而LC-MSMS 可用于精准定量[2]。

2.3 有害微生物的检测

饲料中的有害微生物不仅会降低饲料品质，畜禽食用后还会扰乱肠胃微生物菌群，对畜禽是一种危害性较大的内源性污染，可直接威胁畜禽生命健康。沙门氏菌和大肠杆菌都是饲料中常见的有害微生物，饲喂时必须除去病原微生物污染的饲料，提高饲料安全性。韩志辉和张红见（2011）通过Dot-ELISA 对西宁市某饲料厂饲料沙门氏菌进行检测发现，Dot-ELISA 法与常规分离鉴定技术的符合率为82.23%，和常规分离鉴定技术相比，ELISA 检测技术不仅缩短检测时间，其较强的特异性和敏感性可以支撑ELISA 技术应用于饲料中沙门氏菌检测[3]。

2.4 生物毒素的检测

真菌是造成饲料毒素产生的关键，饲料中常见的生物毒素有黄曲霉毒素、玉米赤烯酮和霉菌毒素等。姚静静等（2019）首先制备了高灵敏度的AFB1 单克隆抗体，并通过ELISA 检测方法对粮食和饲料中的黄曲霉毒素B1进行检测，其AFB1 单克隆抗体的效价高达5.12×105，检测范围为0.014～1.920ng/ml，且与其他霉菌毒素无交叉反应，成功建立了灵敏度高和特异性强的AFB1 间接竞争ELISA 检测方法[4]。张元杰（2018）通过ELISA 检测技术测定临沂市5 个县区150 份煎饼类食品中黄曲霉毒素含量，结果发现，140 份样本都检出了黄曲霉毒素，其中102 份为黄曲霉毒素B1，含26 份黄曲霉毒素B1超标样本[5]。

2.5 转基因食品的检测

转基因食品是当下发展最快的新型食品，可以通过基因工程人为改变生物形状、营养价值、产品品质和数量等，但转基因食品的安全性、伦理学和环境污染情况也一直困扰广大消费者的选择，越来越多的国家采取强制性转基因食品标识让消费者享有知情权。转基因食品检测的常用方法有聚合酶链式反应、ELISA 检测技术、侧流技术和生物芯片技术，其中ELISA检测方法特异性强、成本低、稳定好，因此被广泛应用于转基因食品安全检测当中。李小宇等（2016）通过双抗夹心ELISA检测技术对转Bar 基因抗除草剂大豆（膦丝菌素乙酰转移酶）进行检测，确定了最低检测限为0.04ng/ml，ELISA 检测技术的重复性变异系数小于3%，且根、茎、花、叶、种子不同部位都可检测到该蛋白的表达[6]。

3 结语

随着人们对动物源性食品安全问题的关注，操作简便、高灵敏度和特异性的ELISA 检测技术被广泛应用于饲料和食品安全检测中，为我国畜牧业健康和食品安全提供重要保障，但要想真正解决饲料和食品安全问题，还需要从源头入手，加强对饲料生产、加工和农兽药销售行业的管理，规范养殖户的饲养方法和药物使用，减少药物残留，为畜禽提供一个健康稳定的环境，才能为广大人民群众提供安心安全的动物源性食品。