低强度脉冲超声在正畸骨改建中的研究进展

李律元，夏伦果，李佳宜，谭 宇，房 兵

正畸治疗2～3年的漫长治疗周期给患者和医生都造成了诸多不便，研究者们正不断致力于开发促进牙移动的方法以缩短正畸的治疗周期。从生物学角度来说，正畸牙移动的基础是牙周组织及牙槽骨的改建，适当的生物学刺激可促进牙周组织及牙槽骨的改建，牙移动速度随之加快。目前，可用于加速正畸牙移动的方法主要有三类，分别为外科手术辅助法[1]、药物治疗法[2-5]和机械物理刺激法，然而，外科手术辅助法存在术后血肿、疼痛、感染的潜在风险，药物治疗法对全身其他系统造成的副作用尚不明确，这两种方法各自的局限性限制了其临床应用。既往研究显示，骨细胞是力效应细胞，力学刺激可以引发骨改建活动，因此，机械刺激法现已成为极具应用前景的促进正畸牙移动的方法，其中，低强度脉冲超声(low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS)近来逐渐受到研究者们的关注。

LIPUS是强度介于30～100 mW/cm2、频率低于3 MHz的脉冲式超声波。当LIPUS在人体介质中传播时，超声传递的能量使组织内发生压力变化，细胞功能随之改变[6-9]。当LIPUS作用于成骨细胞、牙周膜细胞及成牙骨质细胞时，其可发挥独特的调控作用，最终在加速牙周组织的改建、加速正畸牙移动的同时，降低牙根吸收的风险。

1 LIPUS对骨组织改建的影响

在牙齿移动的过程中，受力牙齿周围产生了张力区和压力区。在张力侧，成骨细胞数量增多，骨形成相关基因表达上调，骨新生活跃；在压力侧，破骨细胞增殖活跃，分泌细胞因子促使牙槽骨发生吸收。张力侧与压力侧分别进行牙槽骨改建，使得牙齿在牙槽骨内发生移动。LIPUS可分别对张力侧与压力侧的骨代谢进行调节，进而影响牙齿的移动。LIPUS在调节骨代谢过程中具有多重作用，广泛调控成骨细胞的增殖、分化及骨基质矿化的过程。LIPUS可增加细胞钙离子的内流，提高成骨细胞内NF-κB1和p38α的活性，进而激活mTOR信号通路，最终促进细胞的增殖[10]。骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)受到LIPUS刺激后，涉及成骨分化的多条信号通路如MAPK通路[11]、FAK-RhoA-YAP通路[12]、PI3K/AKT通路[13]激活，细胞内成骨标志基因OCN、OPN、ALP表达提高，BMSCs发生成骨向分化[14-15]。LIPUS刺激也使OPG/RANKL比值发生变化，BMSCs中OPG表达上升、RANKL表达下降，OPG/RANKL表达比例相应提高，进一步促进局部的骨再生[16]。LIPUS可提高细胞外基质矿化程度，Angle等[17]的研究结果表明，使用LIPUS连续刺激大鼠BMSCs 21 d后，基质矿化提高水平提高了82%。目前，频率1.5 MHz、强度30 mW/cm2、20 min/d的LIPUS是骨科学中较为公认的利于骨愈合的超声参数，应用这一参数的EXOGEN超声系统已被美国FDA批准，应用于加速长骨骨折愈合。

LIPUS对于牙槽骨来源的BMSCs(alveolar bone derived mesenchymal stem cells, ABMSCs)具有类似的调控作用。LIPUS可通过激活PI3K/AKT通路刺激ABMSCs的增殖；细胞经LIPUS刺激后，基因CD29、CD44、COL1和OCN的表达水平明显提高；对ABMSCs连续进行21 d的LIPUS刺激后，茜素红染色结果表明超声刺激的细胞外基质矿化程度显著提高[18]。体内研究结果显示，LIPUS应用于大鼠牙移动模型时，大鼠牙槽骨组织中成骨相关基因RUNX2及BMP2的表达上升[19]，随着正畸牙移动，牙槽骨再生能力明显增强，局部牙槽骨骨量显著增加[20]。

LIPUS在调控破骨细胞功能中也发挥着重要的作用。LIPUS既可通过调控成骨细胞分泌细胞因子间接调控破骨细胞的功能，也可直接调控破骨前体细胞的分化。LIPUS可下调成骨细胞分泌细胞因子白细胞介素6(interleukin-6)及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，二者均在破骨细胞早期的激活与分化中起到重要作用[21]；LIPUS 还可通过降低成骨细胞RANKL的分泌抑制破骨细胞的分化与成熟[16]。关于LIPUS对破骨细胞的直接作用，不同文献间出现了分歧；一种结果认为LIPUS促进了破骨细胞的分化并提高了破骨细胞的活性，Carina等[22]的研究表明，LIPUS降低了小鼠巨噬细胞系RAW 264.7中组织蛋白酶K、MMP9及TRAP基因的表达，提示细胞破骨向分化受到抑制；Meng等[23]的研究结果同样表明LIPUS抑制了破骨前体细胞的分化，他们将LIPUS 作用于小鼠巨噬细胞(bone marrow macrophages，BMMs)并同时进行破骨诱导，可观察到TRAP阳性细胞数量下降及TRAP阳性面积减少，说明RANKL诱导的BMM破骨向分化能力下降，进一步研究其内在机制发现ERK/c-Fos/NFATC1信号轴激活。另一种结果显示LIPUS增强了破骨细胞活性，Feres等[24]的实验发现，在RANKL诱导的小鼠巨噬细胞系RAW 264.7破骨向分化过程中，如辅以LIPUS刺激，可增强其对碳酸盐磷灰石的吸收能力。可见关于LIPUS对破骨细胞的影响，不同研究结果分歧较大，这值得进一步研究与探索。

LIPUS在调控骨代谢中的独特作用使其在正畸临床治疗中的应用具有一定的可行性。最新研究结果显示，LIPUS加速正畸牙移动的作用已获得动物实验研究结果的支持。栾俐阳等[25]发现，将LIPUS应用于大鼠正畸牙移动模型中， LIPUS刺激组大鼠从第7天起即表现出牙移动速度加快的迹象，局部组织中压力侧牙槽骨中破骨细胞数量增多，张力侧牙槽骨骨新生活跃[17]；Arai等[20]研究发现，将LIPUS作用于大鼠正畸牙后，4周内牙齿移动距离为(6.36±0.13)mm，相比对照组的移动距离(6.23±0.09)mm显著增加(P<0.05)，压力侧牙槽骨中的破骨细胞数量及张力侧的牙槽骨量较对照组均明显提升；Alazzawi等[19]的研究表明，LIPUS刺激的大鼠牙周组织中RANKL、RANK、OPG及RUNX2的表达水平升高，上调的成骨及破骨活性引起局部骨代谢速度加快，牙移动速度随之加快，重建后的牙槽骨骨量亦有显著提高。

正畸牙移动的体内试验表明，压力侧牙槽骨中破骨细胞数量呈现增加的趋势，这一现象在体外实验未观察到，可能是由于体外实验无法模拟正畸治疗压力侧的牙槽骨力学环境而导致。进一步有效模拟正畸治疗中张力与压力环境下的LIPUS引导成骨细胞及破骨细胞分化的实验，对进一步研究LIPUS的生物作用机制具有重要的意义。

2 LIPUS对牙周膜改建的影响

在正畸牙移动过程中，牙周组织经历着一系列改建变化。在正畸压力侧，牙周膜受到压迫，牙周间隙变窄、血管受压，基质及胶原纤维降解，破骨细胞分化形成并活跃运动；在张力侧，基质及胶原纤维增生，成骨细胞增殖与分化增加，骨新生现象活跃。若在此过程中，如果牙周组织改建失衡，则会出现如牙周垂直骨高度降低或牙槽骨厚度减少的不良反应。因此，如何在正畸治疗过程中保证患者牙周健康、减少牙槽骨量丢失，是临床中亟待解决的问题。既往研究表明，LIPUS对牙周组织具有保护作用。牙周膜干细胞(periodontal ligament cells，PDLCs)是一类存在于牙周膜内的干细胞，具有多向分化的潜能，在牙周组织的再生及改建中起着关键的作用，当PDLCs受到LIPUS刺激后，细胞内成骨分化蛋白表达水平提高，细胞发生成骨向转化，引导骨组织再生。文献报道，LIPUS可激活PDLCs中Integrin β1-AKT 信号通路，细胞内OCN、OPN、COL1、ALP等成骨相关基因的表达上调，细胞外基质钙沉积增加[26-27]；Wang等[28]对犬PDLCs进行研究发现，LIPUS可提高细胞成骨向分化能力，BSP、OPN及COL-3的mRNA表达增加，将该参数的LIPUS应用于犬牙槽骨缺损模型中，连续处理8周后局部牙槽骨新生骨量增加，骨小梁的数量及厚度亦明显提高；将LIPUS作用于牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts，HGF)也可观察到类似的促成骨分化作用，LIPUS刺激后细胞内成骨分化标志物ALP及OPN的表达上升，但细胞的增殖能力未见明显提高[29]。

LIPUS在抑制牙周组织炎症反应中同样发挥着不可忽视的作用。LIPUS作用于PDLCs后可抑制NF-κB信号通路的激活，下调细胞内炎症因子IL-6、IL-8的表达[30-31]；牙周膜成纤维细胞(periodontal ligament fibroblasts，PDLFs)受到LIPUS刺激后，细胞内IL-1、IL-6、IL-8、RANKL基因的表达下降，趋化因子CCL2、CXCL1及CXCL10的表达亦同步下降[32]。可见适度的LIPUS刺激可抑制牙周组织的炎症反应，牙周组织内温和的炎症反应可进一步促进局部骨组织的再生[33-34]。

3 LIPUS对牙骨质改建的影响

正畸诱导的牙根吸收(orthodontically-induced inflammatory root resorption，OIIRR)是正畸治疗常见的并发症之一，其多从根尖部开始发生，主要表现为牙根进行性地吸收，导致牙根变得短而钝，当吸收到一定程度后则会影响牙齿的功能与稳定。牙根吸收的机制与骨吸收类似，若牙骨质周围炎症反应明显、牙骨质的骨代谢平衡被破坏，则会新生大量破牙骨质细胞，吸收牙骨质组织。研究表明，LIPUS可有效缓解正畸引起的牙根吸收。Dalla-Bona等[35]研究发现，频率为1 MHz、强度为30或150 mW/cm2的超声可提高小鼠成牙骨质细胞系OCCM-30中Col1、ALP及OPG基因的表达，强度为150 mW/cm2时效果更佳。Inubushi等[36]发现，在大鼠正畸模型中，LIPUS刺激使牙根吸收长度及吸收面积下降，组织学检测结果表明牙根中破牙破骨细胞数量减少，为进一步探索其中机制，Inubushi等将频率为1 MHz、强度为30 mW/cm2的LIPUS作用于OCCM-30及小鼠成骨细胞系MC3T3-1，并施加7 kPa的压缩力以模拟正畸过程中压力侧反应，发现OCCM-30细胞内OPG基因表达量显著上升、RANKL基因表达受到抑制，该结果提示LIPUS可通过调控OPG/RANKL比值调控牙骨质代谢、促进牙骨质新生。值得注意的是，相同处理条件下，成骨细胞系MC3T3-1中RANKL基因表达量显著上升、OPG/RANKL比值下降，提示骨代谢向破骨方向发展，这说明相同参数的LIPUS可在骨组织及牙骨质组织中产生不同效应。在正畸治疗中，最佳反应应是骨组织发生活跃改建的同时牙骨质维持稳定，LIPUS在骨及牙骨质中产生的不同影响能使其同时满足这两个条件。

LIPUS缓解牙根吸收的效果在动物模型中得到证实。Al-Daghreer等[37]发现，经LIPUS处理后，比格犬正畸牙牙根表面吸收陷窝的数量及体积均有显著下降，修复性牙骨质厚度较对照组增加，这与Crossman等[38]的实验结果一致；Gul Amuk等[39]对经LIPUS刺激后的牙骨质组织进行检测发现，组织中RANKL表达水平降低、OPG表达水平提高，环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)的表达量亦出现降低，说明炎症反应水平有所下降。El-Bialy 等[40]使用随机对照实验对LIPUS减缓牙根吸收的作用进行验证，他们招募21例正畸治疗患者，使其在正畸治疗过程中佩戴频率为1.5 MHz、强度为30 mW/cm2的LIPUS设备，患者每4周拍摄一次CBCT以观察牙根吸收及牙齿移动情况，分析CBCT可发现，对照组平均每周牙根吸收长度为(0.022±0.022)mm，经LIPUS刺激后可下降至(0.009±0.022)mm，牙根吸收程度显著减轻，且每周牙移动距离由(0.266±0.092)mm提高至(0.232±0.085)mm，说明LIPUS在保护牙根的同时具有提高牙移动速度的效果。

Dahhas等[41]将LIPUS作用于骨质疏松大鼠的正畸牙移动模型中，发现实验组牙根吸收长度及吸收量较单纯骨质疏松正畸大鼠均有所降低，说明LIPUS对牙根的保护在伴有系统疾病时可能仍有效。因此，于正畸治疗中应用LIPUS可在促进局部牙槽骨改建的同时，维持牙骨质的稳定、保证正畸牙的稳固，这对正畸治疗预后的改善具有显著的帮助。

4 总结与展望

综上所述，LIPUS在正畸牙移动过程中，广泛调控成骨细胞、牙周膜细胞与牙骨质细胞的功能，其主要生理功能有：①促进成骨细胞的增殖与成骨向分化，增加正畸张力侧新生骨骨量；②抑制牙周组织中炎症反应，促进牙周膜相关细胞成骨能力；③提高牙骨质组织中OPG/RANKL比值，减缓压力作用下发生的牙根吸收。LIPUS的功能使其在正畸临床治疗中可发挥加速牙齿移动、保护牙根的作用，且由于其无创、安全的特点，其在临床治疗有重要的应用价值。