噬菌体对口腔疾病发生发展和治疗的影响及机制

苟 册，贾小玥，李雨庆，杨 燃，邹 静

病毒是人类口腔微生物群落中的重要组成部分，与口腔健康息息相关[1]，噬菌体是特异性感染细菌、真菌等微生物的病毒，由蛋白质外壳中包含DNA或RNA基因组成，是最主要的口腔病毒[2]。根据其生活方式的不同，噬菌体可分为毒性噬菌体(virulent phage)和温和噬菌体(temperate phage)。毒性噬菌体，又称为溶菌性噬菌体(lytic phages)，以裂解周期为特点，通过注入并复制其DNA导致宿主细胞裂解并释放其子代噬菌体。温和噬菌体，又称为溶原性噬菌体(lysogenic phage)，启动溶原性周期后，这种噬菌体可将其基因组整合到宿主细胞染色体中或将其维持为质粒，并随宿主的繁殖不断生成含有噬菌体的溶原性细胞。特定情况下温和噬菌体也可能启动裂解周期[3-4]。

噬菌体是口腔生态系统中稳定并具有特异性组成的部分，在人类口腔生态系统中具有重要作用[5-6]。噬菌体在口腔中广泛分布，可与宿主相互作用保持口腔微生态的相对稳定。在牙周炎、龋病等口腔疾病中，相关噬菌体丰度显著改变，提示噬菌体与部分口腔疾病的发生发展息息相关，但具体机制尚不清楚[6-7]，因此本文将对噬菌体在人类口腔微生物群落中的分布特点及其对口腔疾病发生发展和治疗的作用和机制作一综述，旨在为相关口腔疾病的发病机制及临床治疗提供新的思路。

1 噬菌体在口腔微生物群落中的分布特点

在早期研究中，Brady等通过电子显微镜观察到牙菌斑中的病毒样颗粒(virus-like particles，VLP)，提示口腔微生物群落存在噬菌体的可能性[8-11]。近年来，多项研究通过宏基因组学测序和重叠谱噬菌体群落(Phage Communities from Contig Spectrum, PHACCS)进一步分析，结果显示人类口腔的微生物群落、牙菌斑和咽峡部微生物群落中均匀分布多种噬菌体[12]。噬菌体在口腔不同部位微生物群落中的分布具有特异性，可受氧气、碳水化合物含量等因素的影响。牙齿的龈上区域生境中含有较多的碳水化合物和氧气，噬菌体主要感染需氧菌，而龈下区域相较于龈上区域为无氧环境，噬菌体主要感染兼性厌氧菌[13]。

2 噬菌体与口腔菌群以及宿主的相互作用

口腔中最常见的噬菌体类型为长尾病毒科、肌病毒科和短尾毒科，长尾噬菌体(Siphoviridae)为溶原性病毒[14]。研究表明，溶原性噬菌体介导的移动遗传元件对于口腔内抗生素耐药性的传播至关重要[15-16]。肌尾噬菌体(Myoviridae)和短尾噬菌体(Podoviridae)为溶菌性噬菌体，能迅速消除其易感宿主，对细菌具有更强的毒力，溶菌性噬菌体导致的细菌死亡占细菌死亡总数的20%～80%，因此溶菌性噬菌体在生物群落中的比例增加是极为重要的细菌限制因素[17]。

口腔噬菌体可以与口腔菌群相互作用，建立噬菌体-细菌感染网络[18]。口腔噬菌体通过噬菌体-细菌感染网络抑制或促进口腔致病菌的生长，参与口腔微生物群的演替过程。噬菌体-细菌感染网络中的噬菌体分为特异性噬菌体和交叉感染噬菌体两类。特异性噬菌体(specific phage)是仅侵袭一种细菌宿主的主要噬菌体类型，其入侵的短片段DNA仅与一类细菌的CRISPR高度相关，遵循一对一的感染模型。交叉感染噬菌体(cross-infective phages, CIP)则是与多种细菌种类有关的非宿主特异性噬菌体，遵循一对多模型，使细菌与噬菌体之间的通信复杂化[18]。

目前，噬菌体对口腔菌群的影响和作用机制尚不明确。特异性的溶原性噬菌体将自身基因整合至致病菌染色体，产生大量子代溶原性噬菌体及溶菌性噬菌体，裂解细菌。CRISPR/Cas系统是细菌针对噬菌体特有的免疫系统[19-20]，溶原性噬菌体可通过转运自身限制/修饰酶等途径来逃避该系统的同源序列[21-23]，从而使其长期持续存在于致病菌中[9,24]。特异性的溶菌性噬菌体可通过吸附、穿入特异性致病菌并合成子代噬菌体，进而裂解致病菌并释放大量的细胞毒素与酶，引起免疫反应，造成口腔组织损伤[25]。口腔噬菌体与细菌之间相互作用，形成了复杂的噬菌体-细菌网络，继而通过多种形式影响口腔微生物群的演替过程。

3 噬菌体在口腔疾病发生发展中作用

3.1 牙周炎

牙周炎是由牙周致病菌诱导的发生于牙周支持组织的慢性炎症性疾病，可导致牙周组织破坏和患牙松动脱落[26-28]。研究发现，牙周炎患者口腔微生物群落中细菌和病毒的丰度均发生改变[21,29-30]。有学者等通过RNA测序分析牙周炎患者及牙周健康受试者的唾液样本，研究结果发现牙周炎患者的溶菌素表达量显著高于牙周健康受试者，而溶菌素是噬菌体的高表达产物，提示牙周炎患者口腔微生物群落中噬菌体丰度增加[1]。李飞等通过提取DNA并采用PCR及特异性引物检测牙周炎患者及牙周健康受试者的龈下菌斑，研究结果发现噬菌体Req-DTP在牙周炎患者中的检出率远高于牙周健康者，证明噬菌体Req-DTP在牙周炎患者牙菌斑中丰度显著增加[31]。

目前，噬菌体与牙周菌群的相互作用以及对牙周炎发生发展的影响和机制尚不清楚。此外，有研究显示在牙周病模型中交叉感染噬菌体与牙周病原体之间呈显著负相关，交叉感染噬菌体可感染多种致病菌并抑制病原菌的生长，降低致病菌的丰度，可能参与调控口腔微生态平衡[18]。有学者通过RNA测序牙周炎患者及牙周健康者的唾液、龈上及龈下生物膜样本，发现牙周病患者较牙周健康者龈下菌斑内的肌尾噬菌体丰度增加，肌尾噬菌体属于溶菌性噬菌体，提示牙周炎患者牙周微生物群落中噬菌体丰度的改变可能与牙周菌群改变有关[21]。另有研究显示，牙周疾病的炎性环境激发细菌的相关应激反应，致细菌对酸性或碱性环境产生抵抗力，诱导某些溶原性噬菌体进入裂解周期，导致细菌裂解[1,29]。伴放线聚集杆菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans，Aa)在患有掌跖角化-牙周破坏综合征儿童的快速毁灭性牙周炎的发病机理中起着关键作用，也是局限性青少年牙周炎(localized juvenile periodontitis，LJP)的疑似病原菌[32]。研究发现，在LJP患者的牙槽骨吸收部位的微生物群落中存在感染伴放线聚集杆菌的噬菌体。该噬菌体具有广泛的宿主范围，最终导致其宿主细菌的裂解，使牙周膜暴露于高浓度的内毒素、外毒素和酶中，并且裂解过程产生大量的有丝分裂原，其能够在牙周膜中产生多克隆免疫反应造成牙周组织的快速破坏。这表明噬菌体、聚集杆菌和牙周组织的快速破坏之间存在密切联系[25]。

3.2 难治性根尖周炎

难治性根尖周炎(refractory periapical periodontitis)是指根管治疗失败使根尖周感染持续存在，导致根尖周病变迁延不愈[33]。粪肠球菌是难治性根尖周炎的感染根管中最常见的微生物，通常是单一感染，是难治性根尖周炎的优势致病菌[34-36]。研究表明，有30%～89%的牙齿根管治疗后失败的患者存在粪肠球菌感染[37-38]，其在营养匮乏的情况下可以长期生存，并对牙髓治疗过程中常用的氢氧化钙治疗有抵抗力[39]。

研究发现，噬菌体可能参与了粪肠球菌介导的难治性根尖周炎病理过程。Stevens等从难治性根尖周炎根管中分离的10株粪肠球菌经过丝裂霉素C处理后，有4株产生了诱导性噬菌体。其中3种溶原性粪肠球菌菌株的噬菌体呈长尾噬菌体特征，另1株溶原性粪肠球菌菌株的噬菌体呈肌尾噬菌体的特征[40]。溶原性粪肠球菌菌株的遗传物质由噬菌体的DNA序列片段所整合，每个粪肠球菌染色体包含多达7个整合的缺陷性噬菌体基因组[41]。包括质粒在内的噬菌体载体的遗传信息还可以显著改变其感染细菌的致病力，位于噬菌体载体上的基因可以编码充当细菌毒素的蛋白质，该蛋白质可以改变宿主细胞抗原性，影响被膜和粘附因子的产生并增强血清抵抗力，从而增加了粪肠球菌的致病性及耐药性[40,42-43]。

3.3 龋病

龋病(dental caries or tooth decay)是在以细菌为主的多种因素影响下，牙体硬组织发生慢性进行性破坏的一种疾病，是人类中最普遍和持久的疾病之一。变异链球菌(Streptococcusmutans,S.mutans)是人类口腔中天然存在的革兰阳性兼性厌氧球菌，是机会性病原体，大量研究证实为人类龋齿的主要致病菌[44]。迄今为止，已发现的S.mutans噬菌体有M102、M102AD、APCM01、e10和f1[45-46]。

Al-Hebshi等通过16S rRNA测序分析有龋及无龋儿童的龈上菌斑样本，研究结果发现有龋患儿龈上菌斑中S.mutans噬菌体M102含量明显高于无龋患儿[47]，提示S.mutans噬菌体可能参与了儿童龋病的发生发展。此外，有研究发现噬菌体M102对S.mutans中数量最多的血清型C具有特异性，往往与其宿主共同被发现，由此认为噬菌体M102可作为S.mutans血清型C的标志，亦可通过此种特性考虑其成为龋病潜在的防治措施[46-47]。

4 噬菌体在口腔疾病治疗中的应用

4.1 牙周炎的治疗

噬菌体疗法可通过裂解性噬菌体特异性杀灭病原细菌，以替代抗生素[48]。具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)是一种革兰阴性厌氧菌，与牙周疾病的发展和进程直接相关[49]。有学者在口腔中发现属于Siphoviridae家族的噬菌体Fnp02，可高度特异性感染具核梭杆菌亚种，并且噬菌体Fnp02基因组具有高水平的甲基化，对限制性内切酶具有高抵抗力，可以保护其DNA[50]。Fnp02可通过特异性杀灭病原细菌影响牙周致病菌具核梭杆菌的丰度，有望作为新型生物控制剂，为牙周炎的临床治疗提供新的思路[27]。

4.2 难治性根尖周炎的治疗

难治性根尖周炎具有一定的临床治疗难度，与粪肠球菌生物膜的抗感染性以及多种耐药菌株等因素相关。Khalifa等[51]通过全基因组测序发现粪肠球菌噬菌体EFDG1，属于肌尾噬菌体，EFDG1在根管感染的体外实验模型中能高效地感染和杀死浮游和生物膜的粪肠球菌，并且EFDG1不携带任何在其他粪肠球菌噬菌体中已发现的毒力基因，例如毒素或抗生素抗性基因。EFDG1噬菌体疗法是目前较为有前景的难治性根尖周炎治疗方法，尤其在生物膜和多药耐药菌株导致的常规抗生素治疗失败时作为辅助治疗策略[51]。另有研究通过噬菌体Ef11/FL1C(Δ36)PnisA处理粪肠球菌感染的牙本质，发现该噬菌体可显著减少万古霉素敏感菌株和万古霉素耐药的粪肠球菌菌株[37-38]。并且Khalifa等发现噬菌体EFDG1能非常有效地消除一个厚100 μm的粪肠球菌生物膜，7 d内生物膜减少量为未处理生物膜的5倍，证明噬菌体对生物膜的破坏率较高[52]。

4.3 龋病治疗

Dalmasso等分离出S.mutans的高度溶菌性噬菌体APCM01，APCM01可在低至2.5×10-5的感染复数(multiplicity of infection)下，数小时内抑制培养基或人工唾液中的S.mutans生长，降低其代谢活性，提示噬菌体APCM01可作为抑制主要致龋菌S.mutans的一种潜在生物疗法[45]。徐晶晶等收集重度低龄儿童龋患者牙菌斑标本，分离培养出S.mutans和远缘链球菌(Streptococcussobrinus，S.sobrinu)，用噬菌体离心出的噬菌体裂解酶ClyR对其进行杀菌活性测试，发现ClyR可在细菌细胞壁上打孔，从而使细菌发生渗透性死亡，证明ClyR对S.mutans和S.sobrinus均有较强的杀菌作用，或许可以作为一种防龋药物应用于临床[53]。Delisle等分离出噬菌体M102及其编码的抗菌酶，以漱口水、凝胶、表皮软膏、牙膏等制剂作为载体，来抑制口腔中细菌(主要是链球菌)的形成，从而达到龋齿的预防[54]。

4.4 口腔黏膜病的治疗

噬菌体可应用于口腔黏膜疾病或创伤的治疗。结核病是一种由结核分枝杆菌复合群(mycobacterium tuberculosis complex, MTBC)感染所引起的传染病，其口腔临床表现主要为结核性口腔溃疡。李宏鸣等采用包含对MTBC敏感的噬菌体Actiphage软膏局部涂抹，用于辅助治疗结核性口腔溃疡，噬菌体Actiphage的溶菌作用对口腔病变处结核杆菌的增殖有一定的抑制作用[55]。

角化细胞生长因子(keratinocyte growth factor，KGF)是一种促进上皮细胞增殖的特异性生长因子。Li等通过抗角化细胞生长因子抗体筛选出具有高结合活性的包含KGF片段的噬菌体，进一步发现2种能与人口腔黏膜上皮细胞(human oral mucosal epithelial cells，HOMEC)的KGF受体相结合的KGF样噬菌体模型肽，后者可促进体外HOMEC增殖并且无致瘤作用，亦对伤口感染有一定抑制作用，提示KGF样噬菌体模型肽可作为促进口腔黏膜伤口愈合的潜在方法[56]。此外，另有研究通过噬菌体展示技术构建KGF噬菌体活性肽，后者对口腔癌放疗术后所导致的放射性口炎有一定治疗作用[57]。

4.5 其他

噬菌体亦可应用于口腔疾病的预防。持续使用包含噬菌体(或其酶)的制剂，如漱口水、凝胶、表皮软膏、牙膏等，可减少口腔疾病相关病原体数量、维持口腔微生物稳态，进而减少口腔疾病的发生[54]。另有研究表明，噬菌体裂解悬浮液加入软膏、乳膏等制成的固体或半固体制剂均能对口腔机会性致病菌有稳定的裂解能力[58]。此外，噬菌体可作为潜在的疫苗传递载体，通过直接接种表面携带有疫苗抗原的噬菌体或将DNA疫苗表达盒整合到噬菌体基因组进行传递，为通过噬菌体疫苗预防口腔疾病提供可能性。

此外，噬菌体还可作为研究口腔微生物组的工具。噬菌体具有特异性和安全性，可与组学技术结合使用，分离出目标菌种，以研究复杂的体外混合生物膜模型以及动物和人体内的复杂联合模型[59]。

5 总结和展望

噬菌体是人类口腔最主要的病毒类型，健康口腔中有大量噬菌体存在，噬菌体在调节口腔微生物群落稳态和口腔疾病的发生发展中起关键作用。近年来，人们已经认识到噬菌体在现代生物技术工业中具有多种潜在应用，包括蛋白质和DNA疫苗的运输工具、基因治疗的载体、抗生素的替代品、病原菌检测工具或筛选蛋白质、肽或抗体文库的工具。

噬菌体在口腔疾病的预防和治疗中有良好的应用前景，与传统的抗生素治疗相比，噬菌体疗法具有许多优势：①噬菌体感染具有特异性，其感染范围从几个菌种到一个以上密切相关的属；②噬菌体存在于宿主时的自我繁殖能力较高，这意味着较少剂量可能足以控制致病菌的感染；③抗生素和噬菌体之间不存在交叉耐药性，使得噬菌体成为治疗抗生素耐药菌的有前景的解决方案；④噬菌体易分离，其制剂成本较抗生素更低；⑤与抗生素相比噬菌体破坏生物膜的效率更高[6,30,60]。

但噬菌体疗法仍需面对很多问题：随着噬菌体制剂的使用，可能会导致抗噬菌体细菌的进化发展；并且噬菌体作为病毒，能导致革兰阴性菌裂解并释放大量内毒素，对机体存在毒性；其次大多数噬菌体具有高度的免疫原性，可促进强烈的免疫反应，导致噬菌体被快速清除或者产生过敏反应[30]。

口腔中噬菌体是普遍存在的，大量临床研究和动物实验已证实噬菌体与口腔疾病的发生发展有关，当前研究显示部分噬菌体对口腔疾病确实有一定的疗效，但事实上目前只有很少数的能够感染并消灭口腔细菌的对应噬菌体被分离[6]。因此，相关噬菌体的分离及其对口腔疾病的治疗尚需进一步深入的研究，期待更多的证据以及更多的研究发挥其优势、优化其弊端，使其广泛应用于人类口腔疾病的预防和治疗中。