Keap1-Nrf2-ARE 通路及其参与肝脏疾病病理机制研究进展

杨绣荣，王 斌，胡晓梦，王婉怡

(浙江海洋大学食品与药学学院，浙江舟山 316022)

氧化应激(oxidative stress，OS)和抗氧化的平衡调节是人体维持内环境稳定和正常生理功能的一个基本调节体系，亦是人体自我保护、抵御疾病的重要机制之一[1-4]。当受到外源(如环境有害物质、紫外辐射、雾霾等)或内源(如肝损伤、肿瘤、炎症等)有害因素伤害时，机体内活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生和清除失衡，过剩的ROS 攻击大分子物质，导致DNA 突变，促使核酸和蛋白质交联，破坏细胞膜结构，导致细胞功能丧失，出现OS[5-6]。因此，OS 在肝损伤、糖尿病、肿瘤、心血管疾病等发生和发展中扮演了举足轻重的作用。研究证实细胞膜和线粒体膜上的磷脂层多不饱和脂肪酸在OS 状态下会发生严重的脂质过氧化反应，造成肝细胞损伤，导致脂肪肝病、肝纤维化、肝硬化和肝癌等疾病的发生[7]。因此，针对OS 导致肝损伤的作用机制开发高效的抗氧化药物可有效预防和治疗该类疾病，也逐渐成为海洋药物的重点研究领域。

OS 状态下过剩的ROS 破坏细胞内大分子物质的生理功能是众多疾病共同的发病机制，而机体形成了一套复杂的OS 应答系统诱导合成系列的保护性蛋白，降低所受的损害[8]。Keap1-Nrf2-ARE 通路是迄今为止发现的最为重要的内源性抗氧化应激通路，其可调控II 相解毒酶和抗氧化酶基因的表达，消除或减弱OS 对细胞和器官的损伤[9]。现有研究表明抗氧化肽、植物多酚、莱菔硫烷和齐墩果酸衍生物等可激活Keap1-Nrf2-ARE 通路，调控下游靶基因的表达，预防和降低OS 损伤，抵制炎症反应的发生[1,3,6]。因此，筛选Keap1-Nrf2-ARE 通路的高效激动剂成为抗氧化药物的研究热点。

1 Keap1-Nrf2-ARE 通路及其在氧化应激中的重要作用

核因子NF-E2 相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)主要在肝、肾、肺、皮肤等代谢性和解毒组织器官中表达，是CNC(cap-‘n’-collar)家族中调节氧化应激反应的一种重要转录因子，其含有一高度保守的碱性亮氨酸拉链结构，与胞浆蛋白伴侣分子Keap1(Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白-1)及抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)共同构成Keap1-Nrf2-ARE 通路，在参与细胞抗OS 和外源性有毒物质诱导的主要防御机制中发挥关键作用，与肝损伤、衰老、癌症等疾病联系密切[8-9]。

II 相解毒酶或抗氧化基因的诱导、激活是机体对氧化损伤和亲电子损伤细胞防御的重要部分，可将有害物质在破坏DNA、蛋白质等生物大分子前清除出细胞。在正常生理状态下，Nrf2 通过N 端与Keap1 特异性结合于细胞质中处于受抑制状态，细胞内II 相解毒酶类和抗氧化物处于基础表达水平。当受到ROS 或其他亲电试剂刺激时，Nrf2 与Keap1 解偶联转移进入细胞核并与小Maf 蛋白结合成异二聚体，进而识别并结合抗氧化反应元件ARE，启动下游II 相解毒酶和抗氧化酶(NQO1、GST、SOD、γ-GCS、HO-1 等)等基因的转录、表达，保护机体和细胞免受OS 产生的过剩ROS 及有害物质的侵害[10-11]。

因此，Keap1-Nrf2-ARE 通路对II 相解毒酶和抗氧化酶的诱导、表达起到决定性作用，是迄今为止发现的最为重要的内源性抗氧化应激通路。

2 Keap1-Nrf2-ARE 通路激动剂的研究进展

Keap1-Nrf2-ARE 通路在保护细胞和器官免受OS 损伤方面起到了决定性作用，而其激动剂的研究也成为开发预防和治疗OS 相关疾病药物的焦点。研究表明Nrf2 的活化主要有2 种方式：(1)作用于Keap1 上的氨酸残基，如Cys-151 和Tyr-141，诱导Nrf2 从Keap1 中释放，或者阻止Nrf2 与Keap1 结合；(2)激活磷酸化信号传导通路，促使Nrf2 磷酸化而与Keap1 解离，进而增加细胞核内Nrf2 的水平[12]。

2.1 肽类激动剂的研究

Keap1-Nrf2-ARE 通路中，Nrf2 与Keap1 结合时Nrf2 处于受抑制状态。因此，根据Nrf2 与Keap1 结合结构域的氨基酸序列设计肽类化合物，将可能得到与Keap1 具有较强结合力的活性肽，可作为Nrf2 与Keap1 结合抑制剂(PPI)，提高核内Nrf2 的水平而发挥其生理功能[13]。TU Jingyi,et al[14]研究表明Nrf2 肽(DEETGE-CAL-Tat)可以显著地降低Nrf2 与Keap1 的结合力，促进Nrf2 进入细胞核启动下游控制的细胞保护基因的表达，减轻机体所受OS 的伤害。ABED,et al[10]利用表面等离子体共振(SPR)和荧光偏振(FP)试验测定了系列Nrf2 肽的Kd 值和IC50值，结果表明9 mer Nrf2 肽(H-LDEETGEFL)的Kd 值为352 nmol·L-1，IC50值为3.48 μmol·L-1，显示出与Keap1 最强的结合能力。在此基础上，ABED 对16mer Nrf2 肽(AFFAQLQLDEETGEFL-OH) 与Keap1 的结合方式进行了研究，结果发现Keap1 上6 个氨基酸残基(Ser363、Asn382、Arg380、Arg415、Arg483 和Ser508)的侧链与16mer Nrf2 上Glu79 和Glu82 的羰基形成氢键，结合于Keap1 的顶部，表明根据Nrf2 的结合域设计两者之间结合抑制剂可以阻断Nrf2 与Keap1 的结合，促进Nrf2 作用的发挥。另外，ZHAO Huihui,et al[15]研究表明胶原肽对H2O2诱导的人肝细胞系HL7702 的氧化损伤有保护作用，其可以及时清除细胞内的ROS，增加Nrf2 的表达水平，提高SOD、CAT 的活性，减轻脂质过氧化反应，消除和减弱OS 所致人的正常肝细胞损伤。

2.2 其他小分子激动剂的研究

除活性肽外，植物多酚等化合物也是Keap1-Nrf2-ARE 通路激动剂研究的焦点。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是茶多酚中的主要抗氧化活性成分，其通过2 种方式激活Nrf2 通路：(1)EGCG 与谷胱甘肽(GSH)结合降低细胞内GSH 水平，导致上游激酶P13K、PKC、JNK 和ERK 的激活，促使Nrf2 磷酸化。(2)EGCG 的电子形式直接与Keap1 上Cys 残基相互作用，诱导Nrf2 解离[16]。莱菔硫烷(SFN)是绿花椰菜中的一种间接的抗氧化剂，其通过激活Keap1-Nrf2-ARE 通路诱导多种细胞保护蛋白(GR、HO-1 等)的合成抵御OS 对细胞的损伤[17]。KERNS,et al[18]实验发现：SFN 可直接活化JNK 激酶，并通过降低GSH 水平激活p38，进而激活转录激活因子AP-1，最终导致角蛋白17 基因转录；另外，SFN 还可以通过降解胞质中Nrf2与Keap1 的结合物而直接刺激Nrf2 的活性。KLESZCZY■SKI,et al[19]实验发现SFN 能增加HaCaT 细胞中Nrf2 活性及Nrf2 依赖性基因(γGCS、HO-1、NQO1)的表达。姜黄素通过对Keap1 上的Cys151 亲电修饰来解离Nrf2-Keap1 复合体，激活Nrf2 的表达，进而诱导GSH 生物合成基因Gclc 和Gclm 的mRNA 来提高GSH 的水平[20]。另外，白黎芦醇、叔丁基对苯二酚、巴多索隆和齐墩果酸衍生物等亦可激动Keap1-Nrf2-ARE 通路，启动Nrf2 依赖的基因表达，在OS 状态下保护细胞和器官[21]。

因此，以Keap1-Nrf2-ARE 通路为靶点，针对性筛选和设计该通路的高效激动剂，将极大提高OS 相关疾病治疗药物开发的成功率。

3 Keap1-Nrf2-ARE 通路参与肝脏疾病病理机制研究

线粒体呼吸链复合体利用电子传递生产ATP，是ROS 的主要来源，而肝脏富含线粒体成为最易受ROS 攻击的器官。因此，OS 是引起肝脏病变的主要机制之一，并贯穿肝病的始终。Keap1-Nrf2-ARE 通路抗肝脏损伤涉及调节肝脏的代谢和解毒等环节，在肝脏疾病的治疗和预防中发挥重要作用[22]。

3.1 对肝代谢酶表达和炎症的调节作用

肝代谢酶的解毒过程中II 相解毒酶催化有活性的I 相代谢产物转化为更具亲水性和稳定性的产物，并在III 相代谢排出体外。Nrf2 通过ARE 序列协同调节系列II 相解毒酶基因和III 相代谢酶中载体的表达，加速毒物的转化和排出[23-24]。另外，Nrf2 通过对炎症细胞因子的调控，减弱细胞的炎症反应和氧化损伤[25]。

3.2 对脂肪肝的保护作用

在高脂肪及酒精环境下，过剩ROS 加速肝脏的损伤，引起脂肪性肝炎，肝纤维化和肝硬化等病症[9]。Nrf2 信号传导通路通过加强抗氧化物和解毒酶基因的表达，保护肝细胞免受脂质过氧化的损伤；同时Nrf2作用于肝内Fas、Fgf21 和CD36 的基因表达，减少脂肪酸从脂肪组织中的释放和肝对脂肪酸的摄取[26]。

3.3 对药物性肝损伤的保护作用

某些药物在肝细胞内经细胞色素P4502E1 代谢产生过量的ROS 等有害物质，进而破坏线粒体膜完整性和膜Ca2+-ATP 酶系[9]。乙酰氨基酚(APAP)介导的肝损害模型研究表明：Nrf2 通过诱导UGT1A6 表达加快APAP 的排泄；另外，APAP 在非毒性剂量下可激活Nrf2，促进GSH 的从头合成，从而产生的GSH 与APAP活性代谢产物结合并增加其排出，减弱APAP 毒性[27-28]。

3.4 对肝癌的预防作用

肝癌是导致癌症死亡的第三大原因。化学致癌物在体内经I 相代谢酶催化后形成具亲电子活性的致癌物，进而引起癌基因和抑癌基因的改变。因此，Nrf2 激动剂如苹果多酚和莱菔硫烷等可有效激动Keap1-Nrf2-ARE 通路，调节II 相解毒酶和抗氧化酶的解毒作用，阻断或逆转癌症发生[29-31]。

3.5 对肝纤维化与肝硬化的作用

肝纤维化的核心问题是ROS 促进肝星状细胞(HSC)激活并转化为肌纤维母细胞，以及胞外基质合成增多而降解不足，是进一步向肝硬化发展的重要环节[9,32]。最新研究显示，Keap1-Nrf2-ARE 信号通路通过促进GCLC、GSTA2 和NQO1 等解毒酶的表达，加速清除肝细胞中的ROS，抑制HSC 的活化，阻断肝纤维化的进程[33]。

4 结论

基于Keap1-Nrf2-ARE 通路参与肝脏疾病病理机制，Nrf2 激动剂已被应用于体内外实验，结果证明激动剂通过激活Keap1-Nrf2-ARE 通路促进II 相解毒酶等系列基因的表达，有效对抗疾病引起的组织损伤。因此，Keap1-Nrf2-ARE 通路被认为是开发保肝护肝药物的一个重要靶点。