免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法测定水环境中微囊藻毒素

卢义博，张小军，严忠雍，伦丽丽，王瑞瑞,4

(1.浙江海洋大学水产学院，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大学海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江舟山 316021；3.江苏美正生物科技有限公司,江苏无锡 214135；4.浙江海洋大学食品与药学学院，浙江舟山 316022)

微囊藻毒素(microcystin，MC)是一类由蓝藻产生的天然毒素，具有单环七肽结构。目前该藻类毒素能够在水华过程中产生大量毒素，且毒性严重，具有遗传毒性、致癌性和多器官毒性[1-4]。微囊藻毒素种类繁多，微囊藻毒素-LR(microcystin-LR，MC-LR)和微囊藻毒素-RR(microcystin-RR，MC-RR)是其中分布最为广泛，危害最为严重的2 种同分异构体[5-8]。世界卫生组织规定的饮用水中微囊藻毒素标准为1.0 μg·L-1，中华人民共和国卫生部在《生活饮用水卫生标准》中将MC-LR 的限量值定为0.001 mg·L-1。鉴于蓝藻水华的发生日益频繁，以及该类毒素对人体健康存在的潜在危害，有必要建立一种简便、高效检测微藻毒素的方法。

目前，微囊藻毒素的检测方法有蛋白酶磷酸抑制法[9-11]、酶联免疫法[12-13]、高效液相色谱法(HPLC)[14-16]及液相色谱串联质谱法(LC-MS)[17-20]等。蛋白酶磷酸抑制法是最为经典的方法，此方法是用32P 标记来制备放射性底物，检测后会带来放射性污染物并且达不到要求的定量结果。酶联免疫法简便快捷、成本较低，但其准确性较差。高效液相色谱法具有重现性好，定量相对准确的优点，但是由于塑料容器中易析出与目标物相似的色谱峰，易出现假阳性的情况[20]。液相色谱串联质谱技术拥有优异的分离能力与和高灵敏度定性和定量功能。但目前文献大多采用固相萃取对样品进行纯化，基质干扰仍较严重，回收率较低。免疫亲和柱(IAC)是利用抗原抗体特异性可逆结合特性的原理制作而成的SPE 柱，由于抗原抗体的高度选择性，使得免疫亲和柱具有良好的吸附净化性能和高度的特异性。本实验利用液相色谱串联质谱的灵敏性和准确性，结合免疫亲和柱的特异性和专一性，建立一套高效、快捷、灵敏度高的微囊藻毒素检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

ACQUITY 超高效液相色谱-质谱仪Quattro Premier XE(美国Waters 公司)；MS2 漩涡混合器(德国IKA公司)；N-EVAP-112 氮吹仪(美国Organomation 公司)；Centrifuge5810 高速离心机(德国Eppendorf 公司)；12通道固相萃取装置(美国Supelco 公司)。

MC 标准品(纯度≥98.0%，德国Dr.Ehrenstorfer 公司)；MC 免疫亲和柱(柱容量3 mL，江苏美正生物科技有限公司)；Waters Oasis HLB 固相萃取柱(60 mg/3 mL)；Waters Oasis C18 固相萃取柱(60 mg/3 mL)；乙腈、甲醇(色谱纯，德国Merck 公司)；乙酸铵、甲酸(美国Sigma 公司)；抗坏血酸、NaOH(分析纯，上海国药集团)；超纯水。

1.2 溶液的配制

MC-LR 标准溶液(100 μg·mL-1)：称取5.00 mg MC-LR 标准品，使用甲醇溶解定容至50 mL，-20 ℃避光保存，保存期限为6 个月。

MC-RR 标准溶液(100 μg·mL-1)：称取5.00 mg MC-RR 标准品，使用甲醇溶解定容至50 mL，-20 ℃避光保存，保存期限为6 个月。

MC-LR、MC-RR 混合标准溶液(1 μg·mL-1)：准确移取适量的MC-LR 标准溶液和MC-RR 标准溶液，初始流动相稀释定容至50 mL，4 ℃避光保存，保存期限为3 个月。

1.3 色谱及质谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；样品室温度10 ℃；柱温40 ℃；进样体积5 μL；流速0.3 mL·min-1；流动相A：0.1%甲酸水溶液（含5 mmol·L-1乙酸铵)，B：乙腈，梯度洗脱：0～1.5 min，80%～20% A;1.5～4.5 min,20%～80% A;4.5～5 min，A 保持80%不变；流速：0.3 mL·min-1。

质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描(ESI+)；检测方式：多反应监测(MRM)；毛细管电压：3.0 kV；离子源温度：110 ℃；脱溶剂气温度：350 ℃；锥孔气流量：50 L·h-1；脱溶剂气流量：600 L·h-1；锥孔电压、碰撞能量、分析物母离子及子离子等质谱多反应监测实验条件如表1 所示。

表1 分析物的质谱多反应监测实验条件Tab.1 Conditions of multiple reaction monitoring for analyte

1.4 样品处理

1.4.1 样品提取

准确量取已充分混匀水样50 mL 于50 mL 具塞离心管中，加入0.5 mg 抗坏血酸，涡旋振荡1 min，用0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH 至7～8，待净化。

1.4.2 免疫亲和柱净化

取出免疫亲和柱恢复至室温，以匀速释放出柱内保护液后，加入样品溶液。待液体排干后，使用5 mL 50%甲醇水洗涤亲和柱，挤干柱内残留液，并弃去以上全部流出液，最后用4 mL 含有1%甲酸的甲醇溶液洗脱，收集的洗脱液于60 ℃氮气下吹干，用1 mL 初始流动相定容溶解，经过0.22 μm 滤膜净化后供液相色谱-质谱分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

本方法采用1.7 μm 粒径的ACQUITY UPLC BEH C18 柱分析目标物，选择正离子模式下加入一定量的有机酸调节流动相的pH 和加入乙酸铵促进MC 的电离，在保证有良好的分离效果的同时具有较为尖锐的峰形。本实验研究比较了甲醇、乙腈作为有机相与0.1%甲酸水溶液（含5 mmol·L-1乙酸铵)水溶液组合成流动相的效果。甲醇作为流动相时，MC 的灵敏度略低于用乙腈作流动相，并且MC 出峰时间较晚，但乙腈作为流动相时能够在6 min 内完成目标物分离和色谱柱平衡。综合比较，选择乙腈-0.1%甲酸水溶液（含5 mmol·L-1乙酸铵)作为流动相。

2.2 质谱条件优化

MC 的极性较强，选择正离子扫描模式，用蠕动泵使用100 ng·mL-1的MC 混合标准溶液进行流动注射分析以改善质谱条件。通过一级质谱全扫描分析，确定MC-LR、MC-RR 的分子离子，调试选择最优锥孔电压和毛细管电压，选用丰度最高离子m/z 135.0 作为MC-LR 定量离子和m/z 135.1 作为MC-RR 定量离子，如图1 所示。调整碰撞能量等条件对MC 进行二次离子质谱分析，获得碎片离子信息，选择最强离子作为定量离子，次强离子定性离子，具体信息见表1。

图1 (A)MC-LR 和(B)MC-RR 质谱多反应监测（MRM）谱图Fig.1 (A) MC-LR and (B) MC-RR mass spectrometry multiple reaction monitoring (MRM) spectra

2.3 免疫亲和柱条件优化

2.3.1 洗脱液的比较和洗脱体积的选择

本实验分析比对了不同性质的3 种洗脱溶剂和洗脱体积考察分析度实验回收率的影响。即采用5 mL的甲醇、1%甲酸甲醇、1%氨水甲醇做为洗脱溶剂，在洗脱过程中将5 mL 的洗脱液均匀分为5 份洗脱液，即每份1 mL，多次淋洗，并且对每1 mL 的洗脱液分析检测，确定其回收率，实验结果如图(A)MC-LR 和(B)MC-RR 所示。实验结果表明，1%氨水甲醇的洗脱效果在3 种洗脱液中效果较差，回收率最低。对于MCLR 来说，洗脱溶剂采用甲醇或者1%甲酸甲醇对实验的回收率影响不大；但是在MC-RR 的结果中显示，1%甲酸甲醇作为洗脱溶剂时其回收率要大于甲醇作为洗脱溶剂时的回收率。综合考虑，本实验选择1%甲酸甲醇作为洗脱溶剂。从两种物质的回收率上来看，当选择1%甲酸甲醇作为洗脱液时，洗脱体积在4 mL的情况下回收率已经接近为零，但是为了保证能够充分洗涤目标物，所以采用了5 mL 的洗脱体积。最终本实验选取5 mL 1%甲酸甲醇作为最终的洗脱条件。

图2 不同洗脱液和洗脱体积对(A)MC-LR 和(B)MC-RR 的洗脱影响Fig.2 Elution effect of different elution solutions and elution volumes on the Elution of (A) MC-LR and (B) MC-RR

2.3.2 不同固相萃取柱净化效果比较

在实验中通常选用固相萃取柱HLB 和C18 柱用于净化降低水质中的杂质。因此实验选择免疫亲和柱、HLB、C18 柱进行实验分析，按照回收率高低和质谱图响应值的大小及干扰程度，比较了经3 种柱子净化后MC 的净化效果。结果表明IAC 和HLB 柱的回收率明显高于C18 柱，HLB 柱的净化效果不如IAC柱，目标峰出峰前有信号比较强的杂质峰。谱图上显示免疫亲和柱的净化效果最好，目标峰附近无明显杂质峰,表明免疫亲和柱具有高特异性的特点。

图3 2.0 μg·L-1 阴性水质加标样品经(A)C18 柱(B)HLB 柱和(C)IAC 柱净化后的MRFig.3 MRM chromatograms of 2.0 μg·L-1 water quality sample cleaned up by(A) C18,(B) HLB and (C) IAC column

2.3.3 基质效应评价

本实验参考MATUSZEWSKI,et al[21]建立的方法来分析基质效应的影响，选择湖水、海水、池塘水、河水作为代表性水体，每种水体做3 个平行样，分别测定MC-LR、MC-RR 标准品溶液的色谱峰面积(S1)和空白水体基质浓缩复溶形成的溶液添加标准品溶液后的色谱峰面积(S2)，以S2/S1(%)的比值作为绝对基质效应评价的标准。实验结果显示湖水中的基质效应是95.28%～102.87%；海水的基质效应是97.23%～105.67%；池塘水的基质效应是96.45%～112.43%；河水的基质效应是95.17%～110.55%。总体的基质效应在95.17%～112.43%之间，在可接受的±12%范围以内波动的。结果表明免疫亲和柱可以降低基质干扰，能够达到良好的净化效果。

2.4 线性范围和定量限

使用MC 混合标准品，准备浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 和20.0 ng·mL-1标准工作溶液，在已优化的实验条件下，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标来绘制标准曲线，结果表明2 种分析物在0.5～20 ng·mL-1浓度范围内线性相关系数均大于0.999 5，满足仪器分析的需要；在3 倍信噪比和10 倍信噪比下分别计算该方法的理论检测限(LOD)和定量限(LOQ)，得出2 种分析物的检出限和定量限均为0.3 ng·mL-1和0.5 ng·mL-1。本方法检出限低，灵敏度高，适用于水环境中MC 的检测。

2.5 回收率和精密度

分别准确量取不含MC 的湖泊水、海水、池塘水、河水50 mL，加入3 种不同浓度的MC 混合标准溶液以使3 种添加样品的MC 含量分别为2.00，5.00 和10.00 ng·mL-1，对每个浓度重复测定6 次，按照本方法进行加标回收率实验，计算回收率和相对标准偏差。结果见表2。MC-LR 在2.00、5.00 和10.00 ng·mL-13个添加水平下的平均回收率在88.52%～94.83%之间，相对标准偏差为0.54%～2.27%之间；MC-RR 在2.00、5.00 和10.00 ng·mL-13 个添加水平下的平均回收率在84.71%～91.59%之间，相对标准偏差为0.39%～5.94%之间。

表2 MC 的加标回收率和精密度实验Tab.2 Limits of quantity,recoveries and RSDs of MC

2.6 实际样品分析

根据《SL 219-1998 水环境监测规范》对无锡市的太湖水，新安区河水，东南大学池塘水，舟山市的河水，水库及海水采样，共计45 份样品。采用本方法进行检测分析，发现新安区河水中检出MC-LR 和MCRR，浓度分别在0.30～2.73 ng·mL-1、0.56～2.67 ng·mL-1，其余样本未检测出微囊藻毒素。结果分析表明，本方法能过满足检测分析要求，能够为开展相关的风险监测工作提供依据。

3 结论

本方法采用免疫亲和柱专一特异性及优秀的净化能力等优点，通过研究免疫亲和柱的自身条件的优化以及结合液相色谱-串联质谱的流动相选择和组成，成功地建立了免疫亲和柱净化-UPLC-MS/MS 检测湖泊水环境中微囊藻毒素的方法。本方法实验过程操作简便、绿色环保、基质干扰小，精密度和回收率高，满足检测分析的要求。