高通量测序技术在白血病临床应用中的研究进展

殷悦，王雅梅

(首都医科大学 a.2017级临床医学“5+3”一体化专业三班,b.基础医学院生化与分子生物学系，北京 100069)

白血病是由造血干细胞恶性增殖、分化障碍、凋亡受阻等机制引起的血液系统恶性肿瘤性疾病。近年来，白血病的发病率呈上升趋势，在我国各种恶性肿瘤致死率中居第六位(男性)和第八位(女性)，在儿童和青少年的恶性肿瘤中居第一位[1-3]。由于白血病的发病机制尚不完全清楚，而其隐匿性、异质性和复杂性[4]，增加了早期诊断的难度，致使一些患者错过最佳的治疗时机；尽管通过放疗、化疗、骨髓移植以及免疫学疗法治疗可以提高白血病患者的生存率，但停止治疗后由耐药引起的复发也成为临床治疗的难题[5]。

随着人类基因组计划的完成，高通量测序技术的突破性发展推动了精准医学时代的到来。高通量测序技术为临床肿瘤学的研究开拓了新思路，提供了解决难题的有效方法[6]。目前，高通量测序技术已被广泛应用于白血病的临床研究，在白血病相关突变基因的筛查、寻找新的治疗靶点、个性化治疗以及预后监测方面均显示出巨大的优势[7]。现主要介绍高通量测序技术在白血病临床诊断、患者风险分层、治疗、预后分析中的应用进展。

1 高通量测序技术概述

1.1高通量测序技术的发展 继Sanger测序为代表的第一代测序技术问世以来，基因测序技术不断发展。2005年，随着瑞士Roche公司的焦磷酸测序技术、美国Illumina公司的Solexa和美国ABI的SOLiD等测序平台的出现，标志着第二代测序技术即高通量测序时代的到来。此后，高通量测序技术进一步发展，出现并行单分子合成测序技术、单分子实时合成测序技术、纳米孔单分子测序技术、基于荧光共振能量传递的测序技术等第三代测序技术[8]。目前，高通量测序技术可以同时对几百万甚至数亿条DNA序列进行测序[9]。第三代测序技术弥补了第二代测序技术的缺陷，具有通量更高、测序时间更短、数据读取速度更快的特点，可提高测序的精确度、降低测序反应的成本，真正实现了单分子测序，已经成为医学研究的重要技术手段。

1.2高通量测序技术的应用 高通量测序技术以大数据、多维度的研究模式提高了医学研究的效率，改变了人们对疾病的认识。全基因组、转录组及表观遗传组学的高通量测序分析在揭示肿瘤异质性、追踪细胞谱系、探索肿瘤克隆演变的复杂机制研究中发挥重要作用[10]。在白血病的临床检测中，国际指南已将越来越多的基因突变列为预后指标，建议利用高通量测序技术筛查多基因突变进行预后评估[11]。高通量测序技术与经典细胞遗传学技术的有效融合使人类对白血病的生物学、遗传学基础有了更深入的了解[12]。

2 高通量测序技术在白血病临床研究中的应用

2.1在白血病诊断中的应用 白血病是造血干细胞异常克隆性疾病，具有高度的异质性，受外界环境因素影响，血液肿瘤细胞会发生动态的基因突变和克隆演变。这种复杂的基因改变是传统技术无法全面检测的，而高通量测序技术可一次检测多种基因变异，有效识别亚克隆，且灵敏度更高，在探索白血病基因突变、肿瘤克隆演变的复杂机制研究中发挥重要作用。

2.1.1混合谱系白血病的诊断 混合谱系白血病是一类恶性程度高、预后差、治疗难度大的急性白血病，因具有独特的临床和生物学特征而引起广泛关注。混合谱系白血病以基因重排为特征，常规的临床诊断方法包括细胞遗传学和荧光原位杂交，在许多患者中无法检测到混合谱系白血病易位伴侣基因。长距离反向聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是混合谱系白血病临床诊断的“金标准”。但长距离反向PCR技术受DNA酶解程度、酶解片段自身环化效率的制约，环化易产生多联体且需要大量的基因组DNA样本。为了克服该技术的局限性，研究人员采用高通量测序的方法，只需要微量RNA样本，结合锚定复合PCR富集快速识别患者标本中广泛的混合谱系白血病融合，采用美国Illumina公司Archer FusionPlex Heme(血红素)和Myeloid(髓样)试剂盒制备的文库，在Illumina平台进行测序。与长距离反向-PCR相比，Archer FusionPlex锚定复合PCR富集高通量测序方法是检测混合谱系白血病基因重排的相对简单而有效的技术[13]。因此，对于混合谱系白血病的临床诊断，Archer FusionPlex锚定复合PCR富集高通量测序有望成为新的技术标准。

2.1.2急性髓细胞性白血病(acute myelogenous leukemia,AML)的诊断 全基因组重测序使得大量临床相关基因可以在一个单一的试验中同时进行评估，快速、经济、有效地识别特定疾病人群的相关突变，在突变基因多和突变谱广的情况下更为有效[14]。急性白血病的突变谱能够鉴别具有诊断预后预测和治疗作用的遗传突变。研究表明，Ion Torrent PGMTM测序可以快速、简便地获得AML患者的基因突变谱，明确患者的基因型诊断，为AML进一步分层诊疗、制订治疗方案提供依据[15]。

田淼等[16]报道了利用高通量微RNA(microRNA，miRNA)测序技术分析AML血浆外泌体miRNA，作为疾病监测的标志物来替代传统骨髓穿刺活检的研究。该研究采用Solexa高通量测序技术，分析了AML患者和正常人血浆外泌体miRNA的表达，获得了211个显著差异表达的miRNA。该结果与Hornick等[17]在小鼠模型中的研究结果一致。其中，血浆外泌体miR-155-5p、miR-335-5p、miR-451a有望作为AML早期诊断的分子标志物，证实了高通量测序技术在癌症早期诊断中的潜力。

高通量测序技术可以改进和细分AML的遗传学诊断，除了现有的世界卫生组织(World Health Organization,WHO)亚型，利用高通量测序的分析发现了AML的3个基因组类别：染色质-剪接体、TP53基因-非整倍性以及IDH2R172基因突变[18]。

2.1.3儿童急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)的诊断 儿童ALL的临床遗传学诊断通常使用核型分析(G带)和荧光原位杂交，但是遗传学技术不能捕获癌症基因组中复杂像差的全部光谱。Nordlund等[19]采用全基因组链读测序技术分析了12例ALL基因组，高精度地解析出由细胞遗传学定义的大多数基因组畸变，甚至在其中10例鉴定出遗传学方法未能检出的结构重排，但DUX4-IGH融合基因未能检出。全基因组链读测序技术在ALL诊断方面可以作为传统遗传学技术的补充，有助于提高ALL遗传学诊断的精准度。

2.2在白血病患者风险分层中的应用 随着白血病研究的不断深入，患者在确诊后还需要进行各种预后指标的全面检查，根据不同的指标对患者进行风险预测和分层，然后制订合理的个性化治疗方案，目的是减少低危患者的治疗毒性，使高危患者得到有效治疗。染色体和各种基因变异是进行风险分层的重要指标，高通量测序技术的应用提高了患者风险分层的准确性。

2.2.1ALL风险分层 RNA测序技术和全基因组测序技术可以检测基因的结构变化和序列改变，细化ALL的亚型分类和风险预测。ALL中有一种高危亚型被称为费城染色体样(Philadelphia chromosome like,Ph-like)ALL。2016年，Ph-like ALL作为一种暂定亚型被纳入WHO急性白血病分类，作为一种独立的亚型存在。随着基因组高通量测序技术的进步，更多与Ph-like ALL高危特点及预后不良有关的基因组改变被不断发现。目前，Ph-like ALL的临床试验正在检测靶向性治疗方法的可行性，研究人员预测高通量测序技术将开拓新颖精确的治疗方案，包括脱细胞技术、以基因变异为导向的残留病灶的监测等[20]。

2.2.2AML风险分层 基于高通量测序的多基因检测在AML的风险分层中也发挥了重要作用。日本科学家选取369例初生儿科AML患者中的139例进行了转录组分析(RNA测序)，在53例患者中鉴定出54个框内基因融合和1个Runt相关转录因子1(Runt-related transcription factor 1，RUNX1)基因框外融合。RNA测序结果揭示了儿童AML中基因重排和突变的复杂性，显示了儿童AML患者和成人AML患者不同的实体特征，因此应重新考虑风险分层，为儿童AML患者临床治疗方案的制订提供依据[21]。

传统的细胞遗传学将AML患者分为良好、中度和不良风险组。然而在包含了大部分患者的中等风险组中，患者治疗结果却各不相同。Lin等[22]的研究利用高通量测序技术分析了112例接受标准治疗的AML患者中的260个基因，从中找到了与预后相关的独立突变基因。在中等风险细胞遗传学的患者中，CCAAT/增强子结合蛋白α基因双突变，异柠檬酸脱氢酶2和核仁磷酸蛋白1基因突变且缺乏FMS样酪氨酸激酶3基因内部串联重复基因的患者更接近于具有良好风险细胞遗传学的患者。甲基胞嘧啶双加氧酶2、RUNX1、ASXL1和DNA甲基转移酶3A基因突变的患者，则类似于具有不良细胞遗传学风险的患者。在此基础上对患者重新分类，显著减少了被分类为中度风险的患者数量。此项研究表明，基于高通量测序的多基因测序在临床上可用于建立指导治疗决策的准确风险分层系统。

应用高通量测序技术建立大量AML患者基因图谱的数据库，为AML的风险分层等多种研究提供了有力支持。在癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)计划的一项研究中，应用高通量测序技术对200例AML患者进行全基因组(50例)或全外显子组测序(150例)，对RNA和miRNA的表达进行分析，得到了突变谱分析数据[23]。Gerstung等[24]设计了可以准确预测缓解率、复发率和死亡率的多阶段统计模型，并在单独的TCGA患者数据集合上成功验证。在模拟中，总生存率不变的情况下，基于新算法的精确风险分层能够将同种异体造血细胞移植术的数量减少多达25%。

2.3在白血病治疗中的应用 高通量测序是分析髓样肿瘤基因变异频谱的有力工具，再与靶向治疗和基因组生物标志物相结合，为许多患者的精准医疗创造了条件[25-26]。传统技术对于基因变异无法深入研究，因而对很多特殊、罕见的病例，高通量测序技术可以弥补传统技术的缺点。

2.3.1侵袭性自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)白血病的治疗 随着高通量测序技术的发展，多基因联合检测可以更好地进行疾病发病机制的研究，基于高通量测序的突变分析的优势更加明显[27-28]。侵袭性NK细胞白血病(aggressive natural killer cell leukemia，ANKL)是NK细胞肿瘤的一种罕见形式，大多数患者短期内出现多器官功能衰竭，甚至在接受及时治疗后数天至数月内死亡，且常规的化疗并不起作用[29-30]。Huang等[31]通过结合全基因组、转录组和靶向测序以及细胞因子芯片对ANKL的发病机制进行了全面研究，先从8例新发ANKL患者的血液中分选带有CD25+CD3-标记的NK细胞、受损的正常粒细胞进行全基因组测序，以寻找与ANKL相关的功能序列。研究人员采用美国Illumina公司的Ampli-Seq对29例ANKL患者的血浆样本进行靶向测序，在48%(14/29)的ANKL患者中发现了Janus激酶-信号转导及转录激活因子(Janus kinase-signal transduction and activator of transcription，JAK-STAT)途径的突变。转录组测序的结果表明STAT3激活和MYC表达对于ANKL细胞的增殖和存活至关重要。进一步研究发现，白细胞介素(interleukin,IL)-10可以刺激STAT3的磷酸化，从而使癌细胞增殖，STAT3磷酸化抑制剂(Stattic)和MYC抑制剂(JQ1)可以抑制癌细胞增殖。该研究利用高通量测序技术，鉴定并在功能上验证了参与ANKL发病机制的IL-10/JAK-STAT/MYC信号转导通路，为开发治疗这种亚型白血病的新药提供了有力的支持。

2.3.2混合表型急性白血病的治疗 应用高通量测序技术分析混合表型急性白血病致病基因潜在的调控位点，可为靶向治疗提供依据。Granja等[32]通过单细胞RNA测序技术和单细胞ATAC测序技术联合分析，使用健康人的外周血和骨髓单个核细胞构建造血发育的免疫表型、转录组和表观单细胞图谱，再将混合表型急性白血病患者的单细胞数据进行比对。结果发现，转录因子RUNX1可能潜在调控混合表型急性白血病患者恶性致癌基因，针对RUNX1抑制剂的研究将为治疗混合表型急性白血病的药物研发提供新思路。Hou等[33]利用高通量测序技术对原发性血小板增多症患者进行单细胞全外显子测序发现了与原发性血小板增多症发病机制相关基因SESN2、NTRK1基因。关键基因的发现可以作为新的靶点，为新药物的研发奠定基础。

2.3.3AML的治疗 通过高通量测序技术筛选出的AML相关突变基因包括核仁磷酸蛋白1、CCAAT/增强子结合蛋白α、RUNX1、FMS样酪氨酸激酶3、TP53、ASXL1等[34]。目前，已被作为治疗靶点列入白血病治疗指南中。应用这些靶点研发的分子靶向治疗药物有望提高AML患者的疗效。如针对AML患者中FMS样酪氨酸激酶3突变的抑制剂米朵妥林，异柠檬酸脱氢酶2突变选择性抑制剂Enasidenib等[35]。Fu等[36]利用TCGA数据，结合德国AML合作组织提供的AML患者的临床和生存信息数据，通过生物信息学分析在全基因组范围内筛选出了与预后相关的标志基因FHL1基因，实验证实FHL1高表达不利于AML化疗和骨髓移植的预后及患者的生存，因此FHL1有望成为新的治疗靶点。高通量测序技术为AML患者的精准治疗提供了技术保障，逐渐推动AML由化疗治疗转为靶向治疗[36]，而精准的靶向治疗还有利于改善患者的预后[37]。

2.4在白血病预后分析中的应用 微小残留病(minimal residual disease,MRD)是指经治疗后患者体内仍存在恶性细胞，是ALL中最重要的独立预后因素。使用高通量测序技术可以检测治疗后ALL患者体内是否存在MRD，从而可以预测并采取措施预防白血病的复发。研究显示，使用高通量测序检测儿童ALL患者体内球蛋白重链基因和互补决定区3基因，有助于分析白血病的分支演变模式；同时通过检测MRD，协助判断ALL患者复发的可能性[38]。目前公认ALL的MRD分析金标准是利用等位基因特异性引物对克隆免疫球蛋白和T细胞受体基因重排进行实时定量PCR。研究显示，高通量测序在预测复发方面的灵敏度高于实时定量PCR[39]；此外，高通量测序还可以提供有关治疗期间和治疗后生理性B细胞和T细胞库的信息，这些信息已显示出与预后相关。因此，高通量测序在预测白血病的复发方面有巨大的潜力且有望成为新的金标准。

在白血病的预后分析中，基因突变也是不容忽视的因素。特定基因突变与疾病的不良预后相关，如FBXW7基因[40]、IL-7R[41]、JAK1[42]。随着高通量测序技术的发展，越来越多与白血病预后不良的基因突变被检出。目前WHO等权威的临床指南已将基因突变引入恶性血液肿瘤的危险度预后分层和细化分类中，临床相关的基因在指南更新中所占比例逐年增加。WHO对于髓样肿瘤和AML的最新更新中包括了两个新的分类：RUNX1突变的AML和BCR-ABL1基因的AML，且2017年欧洲白血病网关于AML的建议风险分层中新增了RUNX1、ASXL1和TP53的基因突变[37]。因此，结合高通量测序技术的基因水平综合评估和最小残留疾病的评估有望进一步改善风险分层和白血病的预后。

3 展 望

高通量测序技术已被广泛应用于白血病的临床研究，在白血病相关突变基因的筛查、寻找新的治疗靶点、个性化治疗以及预后监测方面均显示出巨大优势，但仍面临许多困难和挑战。高通量测序技术测定的致病基因靶点，需要进行大量验证以区分白血病基因变异的共性和异质性，排除干扰因素。高通量测序技术应用于临床诊断仍缺少规范的操作指南和数据解读标准，不同的实验室测序方法、平台、阅读深度和变异分析可能不同。此外，通过高通量测序技术测定的标志物目前还无法取代大多数的形态学检查，需要大量的临床研究制订相关标准。为规范高通量测序技术在血液肿瘤诊疗中的应用，中国抗癌协会血液肿瘤专业委员会联合多家权威机构和专家共同制订了《二代测序技术在血液肿瘤中的应用中国专家共识(2018年版)》[43]，该共识的制订对高通量测序技术在血液肿瘤中的临床应用起到规范化的作用，为提高我国血液肿瘤的诊疗水平发挥重要作用。

美国国立癌症研究院提出的精准医学概念是将个体疾病的遗传学信息用于指导其诊断和治疗的医学。随着高通量测序技术的发展，未来人们利用单分子测序技术可以建立个人基因组的信息档案[44]，人类对疾病的认识更加微观，从基因的层面寻找治疗靶点，实现精准医疗。高通量测序技术在白血病临床诊断、治疗、预后以及新药研发方面的应用中已经展示了巨大的潜力，对白血病的分类细化甚至为罕见病的治疗带来希望。目前，高通量测序技术还在飞速发展，其潜力有待进一步发掘。可以预见，随着与发病机制相关的突变基因、细胞信号通路和靶点的不断发现，白血病有望早日实现精准医疗。