奥沙利铂致肝纤维化的机制研究

周洋，王凯，张子谦，刘洋

(1.哈尔滨医科大学附属肿瘤医院影像中心，哈尔滨 150000； 2.哈尔滨医科大学附属第四医院TOF-PET/CT/MR中心，哈尔滨 150001)

奥沙利铂是进展期结直肠癌临床治疗的一线用药，其在用药过程中的不良反应不可忽视，了解奥沙利铂所致不良反应的发生过程对于相关疾病的诊疗发展必不可少。奥沙利铂用于原发肿瘤化疗的疗效很好，但同时也可导致药物性肝脏损伤，相关文献表明，肝窦阻塞综合征(hepatic sinusoidal obstruction syndrome，HSOS)是奥沙利铂最常见的不良反应，具体表现为肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cell，LSEC)损伤以及肝窦阻塞引起的相关症状，最终可进展为肝纤维化甚至肝硬化[1-3]。近年来多项研究发现，受损LSEC与肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)之间存在一系列的生化转导和机械转导，通过多条路径最终激活HSC产生胶原纤维，故可将HSC作为肝纤维化的标志[4-5]。现就奥沙利铂致肝纤维化的作用机制予以综述，以期明确病理机制及其重要通路，找出其中的关键作用靶点，以为奥沙利铂导致肝纤维化的早期诊断、精准治疗等提供参考。

1 奥沙利铂引起的HSOS

1.1HSOS HSOS是以受损LSEC为基础发展形成的一种肝脏血管性疾病。各种原因所致的LESC肿胀、坏死、脱落，导致微血栓形成，进而引起肝窦阻塞、显著扩张充血等肝内窦性门脉高压症状，病理进展中，伴随肝板结构破坏、肝细胞坏死，尤其是肝小静脉壁增厚、纤维化、管腔狭窄甚至闭塞，血窦内、窦周和小叶间静脉内有大量胶原蛋白沉积。临床多表现为肝区疼痛、肝大、腹水等，如果未及时干预，可进展为肝纤维化、非门脉性肝硬化甚至肝功能衰竭等一系列不可逆性病变。Rubbia-Brandt等[1]对153例大肠癌肝转移患者的回顾性分析发现，术前接受以奥沙利铂为基础化疗治疗患者的HSOS患病率高达51%，而未接受化疗患者未发生HSOS。HSOS的肝脏病理改变以小叶中心区损伤为主，其特征为不同程度的肝窦扩张、肝细胞萎缩，伴有红细胞外渗，或伴有部分肝窦周围纤维化和纤维化性静脉阻塞。通过免疫组织化学标记LSEC和HSC发现，在严重肝窦扩张区域，LSEC表现为“缺失”状态，HSC则沿扩张肝窦持续存在，与正常肝脏细胞相比，小叶内几乎所有HSC中的α-平滑肌肌动蛋白表达增强，表明HSC处于激活状态。通过电子显微镜进一步观察发现，肝窦扩张区域的LSEC形态变圆并发生肿胀，细胞核周围的染色质凝聚，肝窦内壁的完整性被破坏，红细胞、血小板等出现外渗[6-7]。此外，病变区域细胞外基质明显沉积，主要由细小胶原纤维组成[8]。另有报道显示，肝窦损伤类型与肝窦扩张程度或分级密切相关[9-10]。因此，奥沙利铂对LSEC的初始毒性损伤会导致肝窦内壁完整性的破坏，随后LSEC产生细胞因子和炎症因子[如白细胞介素(interleukin，IL)-6、血小板衍生生长因子(platele derived growth factor，PDGF)、金属蛋白酶组织抑制因子、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)]，进而激活HSC并增加细胞外基质中纤维蛋白含量，从而改变早期肝脏细胞的微环境；随着基质沉积，肝窦乃至整个肝脏形状及硬度均发生改变，而LSEC以及红细胞脱落与血小板形成栓子，继而引起肝窦阻塞，肝内血流动力学改变，肝窦扩张进一步加重。

1.2肝窦扩张的原因 HSOS以肝窦扩张为病理基础。Marzano等[11]认为，肝细胞萎缩、肝窦阻塞、肝窦重塑是肝窦扩张的三大原因，其可能是奥沙利铂导致肝脏损伤的病理基础。

1.2.1肝细胞萎缩 肝窦周围肝细胞萎缩可造成肝窦管腔的扩大。在一系列以奥沙利铂为基础化疗的小鼠实验中，Robinson等[12]发现，化疗后小鼠均出现肝窦扩张和肝细胞萎缩，且天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶均升高，而未进行化疗的对照组小鼠无上述变化。此外，临床也存在类似现象，Soubrane等[2]通过对术后以奥沙利铂为基础化疗方案的大肠癌肝转移患者的研究发现，59%的患者出现了严重的肝窦损伤；且单因素分析显示，肝窦损伤与天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶的升高相关。通过聚合酶链反应和蛋白印迹技术发现，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制点p21[Cip1]是奥沙利铂治疗的小鼠肝脏中高度上调的基因之一，其主要在肝窦损伤区域LSEC表达，p21[Cip1]表达增加通常被认为是细胞衰老的标志，该过程以细胞周期停滞在G1期为特征；此外，与细胞衰老相关的组织纤溶酶原激活抑制点纤溶酶原激活物抑制剂1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)也有上调[12-14]。p21[Cip1]和PAI-1的表达均受转录因子p53的调控[15]，并作为细胞损伤的回应，如DNA损伤或发生氧化应激时，p53发生磷酸化并具备转录活性，表明其可能是细胞衰老的原因[12,16]。细胞衰老过程中，发生细胞萎缩、凋亡，细胞体积变小导致肝窦外周支撑作用下降，细胞功能受损导致肝窦调节能力降低，因此肝窦发生扩张性改变。

细胞衰老与多种趋化因子和细胞因子的表达增加有关。基因分析显示，以奥沙利铂为基础化疗方案小鼠肝脏中的人类细胞因子IL-8的鼠源同源物即CXC趋化因子配体1上调[12]。据报道，骨髓移植可致HSOS患者血清IL-8水平升高[17]。另有研究发现了以奥沙利铂为基础化疗方案小鼠肝脏中与衰老反应有关的其他关键介质(CXC趋化因子配体2、单核细胞趋化蛋白1和IL-6)的上调[12]。可见，奥沙利铂毒性引起的炎症、细胞间旁分泌可影响肝脏细胞萎缩过程。

1.2.2肝窦阻塞 肝窦阻塞由LSEC和红细胞脱落或肝窦周围纤维化等原因引起，可导致肝窦内压力增高、肝窦扩张改变。奥沙利铂的排泄过程需要谷胱甘肽的参与，造成肝内谷胱甘肽含量下降[18-19]。实验表明，奥沙利铂诱导的HSOS小鼠肝内谷胱甘肽水平显著降低，且与氧化应激反应相关的多种基因(如金属硫蛋白1、血红素加氧酶1和超氧化物歧化酶3)的表达均上调，而核转录因子红系2相关因子2及其调节的硫氧还蛋白1的表达水平均降低；进一步加用抗氧化剂后发现，肝窦内皮破坏的发生率降低至25%，且p21[Cip1]和PAI-1的表达降低，核转录因子红系2相关因子2的转录活性增高[12-14]。在肝脏内抗氧化剂减少与氧化剂增多的双重作用下，LSEC以及窦周其他细胞可能更易受损，而受损或凋亡的细胞及细胞碎片将脱落至肝窦内。

此外，在奥沙利铂诱导小鼠肝脏发生HSOS的过程中，凝血级联反应激活，血管性血友病因子、组织因子、凝血因子Ⅹ及凝血因子Ⅹa受体蛋白酶激活受体(protease-activated receptor，PAR)-1和PAR-2表达上调，导致血小板在肝窦聚集，为血栓形成提供了必要条件[13]，且该过程与驱动HSOS相关的基质重塑过程具有一致性，凝血级联反应可能与基质重塑之间形成了串扰，凝血Ⅹa因子通过PAR-1起作用，可将潜伏状态的转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β转变为活性形式[12,20]，研究表明，经四氯化碳处理PAR-1基因敲除小鼠的纤维化程度低于野生型[21]。凝血级联反应的激活与肝细胞的凋亡导致栓子形成，而肝窦周围局灶性再生增生和纤维化(即肝窦重塑)，使肝窦形态改变，最终导致肝窦阻塞。各种原因所致肝窦阻塞内的血流动力改变均会引起肝窦扩张。

1.2.3肝窦重塑 肝窦重塑与LSEC、HSC及肝细胞密不可分，奥沙利铂作用于肝脏，引起LSEC的凋亡和再生、肝窦周围肝细胞的局灶性增生以及HSC的活化，上述变化均可直接或间接引起肝窦血流动力学的改变[22]，最终导致肝窦扩张。IL-6被认为是一种增殖细胞因子，通过非受体型酪氨酸激酶(Janus kinase，JAK)1/信号转导及转录激活因子3(signal transduction and activator of transcription 3，STAT 3)信号转导途径在肝再生中起作用[23]。经奥沙利铂治疗后，出现严重HSOS伴再生增生小鼠肝脏中的STAT3表达显著增加，其可能由IL-6介导，表明JAK1/STAT3信号转导途径在HSOS发病机制中具有潜在作用[12]。特定JAK抑制剂AG490对JAK1/STAT3信号转导途径的抑制作用可阻止HSC的早期激活[24]，从而抑制肝纤维化的发生。

有证据显示，在基于奥沙利铂的化疗中，肝脏VEGF家族成员表达上调[12,25]。VEGF在HSOS的发病机制中起关键作用，研究报道，通过VEGF受体2和细胞分裂周期蛋白42激活内皮细胞，导致c-Jun氨基端激酶磷酸化，随后MMP-9表达上调[26]。由于贝伐单抗阻断VEGF可促使LSEC下调MMP的表达，而MMP家族基因在肝纤维化的形成中起重要作用，故针对VEGF-A的单克隆抗体贝伐单抗可降低结直肠癌肝转移患者HSOS的发生率[3,27]。基因分析显示，在奥沙利铂引起HSOS的过程中，IL-6、凝血酶调节蛋白、血管性血友病因子、Ⅲ型胶原(collagen type Ⅲ，COL3)A1、COL3A2、PDGF-A、金属蛋白酶组织抑制因子-1、MMP-2及VEGF-C等相关基因表达增加[25]。肝窦重塑是在肝细胞萎缩和肝窦阻塞的基础上发展形成，其中HSC是主要参与者，HSC的激活受到多方面因素的影响，而完整、正常的肝窦是阻止HSC激活的关键。

通常TGF-β和PDGF被认为是HSC发生纤维化和增殖的关键刺激因素[27]。实验表明，奥沙利铂诱导的HSOS小鼠肝脏中的相关胶原基因表达上调，TGF-β和胶原蛋白Ⅰ水平明显升高，早期肝损伤病理切片仅显示胶原蛋白沉积，未见明显肝纤维化改变，提示奥沙利铂与晚期肝损伤密切相关[12]。PDGF是HSC增殖和活化的主要细胞因子，其亚型PDGF-C和PDGF-D与纤维化和肝癌有关，在肝纤维化的胆管结扎模型中，PDGF-D显著上调，从而增加了培养激活的HSC增殖以及细胞外基质内胶原蛋白的表达[28]，可能由PDGF磷酸化并通过磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B途径促进HSC增殖和活化导致[29]。此外，对VEGF和PDGF信号的双重抑制可显著减少肝窦新血管形成(即CD31和VEGF受体2的表达)和新血管的周细胞覆盖(即α-平滑肌肌动蛋白和PDGF受体β的表达)，可明显降低门静脉压力，抑制肝窦扩张[14,30]。

可见，肝脏细胞萎缩、肝窦阻塞及肝窦重塑并非单一进展过程，三者相互存在、相互作用、共同发展，故患者病情变化复杂。因此，探究LSEC与HSC的关系有助于进一步认识肝纤维的过程。

2 HSOS诱发肝纤维化

肝脏内通过相互作用来调节细胞的生长、增殖、迁移和分化，并保持其正常的细胞表型。 在这个互动网络中，健康或受损的细胞会成为邻近细胞的正或负调节剂，包括通过信号传导、受体-配体复合物、直接或间接接触等方式。HSC活化是肝脏纤维化的前提，而正常功能的LSEC对于HSC的活化起屏障作用，HSC的活化与LSEC功能的改变息息相关[30-31]。

2.1肝窦内壁完整性的破坏是纤维化发生的重要前提 LSEC是接触血液成分并形成肝窦屏障的肝细胞群，是肝脏微循环的关键调节器，在肝内细胞间串扰中起关键作用。肝微脉管系统的损伤激活了HSC的转分化，使HSC转变为具有增生性和纤维化性的肌成纤维细胞样表型[32]。

在奥沙利铂引起的肝脏损伤事件中，药物毒性致使LSEC损伤、死亡，肝窦内皮的完整性破坏，引起肝窦周围一系列的串扰反应，进而导致HSC的活化，如炎症反应中IL-6可通过gp130/STAT3信号途径促进HSC的增殖和活化[24]；凝血级联反应被激活后，凝血因子Ⅹa通过PAR-1可以将TGF-β激活，而既往TGF-β和PDGF被认为是HSC发生纤维化和增殖的关键刺激因子。此外，其他与肝纤维化相关的COL3A1、COL3A2、金属蛋白酶组织抑制因子-1和MMP-2表达的增加也提示了HSC的活化，表明氧化应激反应也参与了肝窦病变的过程[25]。另有研究发现，LSEC上存在可清除胶原纤维的甘露糖受体，肝窦损伤后，LSEC的缺失使胶原蛋白清除受阻，导致细胞外基质沉积、变硬，肝窦周围形成的这种硬度增加的环境进一步通过机械转导来激活HSC，使肝脏纤维化进一步发展[4-5,33-34]。LSEC对于阻止HSC的活化至关重要，LSEC的损伤被认为是一系列肝脏病变的起始，由正常LSEC组成的肝窦内皮系统可阻隔药物毒性对其他肝脏细胞的损伤，在调节肝脏微循环状态方面至关重要，还在肝纤维化的发展过程中参与细胞外基质内纤维的降解。

2.2LSEC与HSC之间的生化转导可诱发肝纤维化 HSC的激活是肝纤维化的前提条件，在正常肝脏中，LSEC维持HSC处于非激活状态的能力是防止肝纤维化的重要条件[30]。LSEC维持HSC非激活状态的能力通过旁分泌因子实现，正常LSEC的特征性超微结构是筛板组织上的窗孔，当LSEC受损时，由骨髓源性的内皮干细胞残基进行修复，但是这种修复是不完全的，生成去分化LSEC或毛细血管化LSEC，而毛细血管化LSEC在形态上显示为这种特征性的超微结构丧失——筛板上窗孔闭合和基底膜的形成[31,35]。而VEGF-内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)-可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylate cyclase,sGC)-环鸟苷酸(cyclic guanosinc monophosphate，cGMP)途径中eNOS活性降低引起的继发反应导致了LSEC的去分化。

血小板反应蛋白1(thrombospondin-1，TSP-1)是在肝纤维化中产生的一种糖蛋白，可调节多种细胞功能。研究发现，TSP-1通过激活CD47和CD36受体抑制sGC、cGMP依赖性蛋白激酶Ⅰ和一氧化氮合酶，具有多个TSP-1重复结构域的血管性血友病因子裂解酶ADAMTS13已被鉴定为CD36的可能配体，去分化LSEC中TSP-1和ADAMTS13蛋白的表达水平明显上调，进而使LSEC的窗孔功能丧失。TGF-β是促纤维化的细胞因子，当TGF-β信号优先通过活化素受体样激酶5传导时，LSEC中TSP-1的表达增加，进而导致LSEC去分化以及HSC的增殖和活化，而当TGF-β信号向活化素受体样激酶1转移时，LSEC功能将得到改善，有助于肝脏纤维化的消退以及防止纤维化的进展[35]。由此可见，正常具有“开窗”功能的LSEC通过生化转导信号作用于HSC，而VEGF-eNOS-sGC-cGMP是上述作用的重要途径，阻断该途径是HSC活化的重要原因之一。

肝素结合性表皮生长因子(heparin-binding epithelial growth factor，HB-EGF)是维持HSC非激活状态的重要条件，HB-EGF的释放需要多种金属蛋白酶的水解切割，实验证实，在去分化LSEC中，大部分相关金属蛋白酶下调，且HB-EGF基因敲除小鼠肝纤维化加剧，进一步表明HB-EGF是LSEC维持HSC非激活状态的必要条件，HB-EGF是HSC活化的抑制剂[35-36]。故认为，VEGF-eNOS-sGC-cGMP途径引起的肝窦“开窗”与HB-EGF共同维持HSC的静止状态，两者的表达之间存在某种联系，但可能并不是唯一的作用机制。

2.3LSEC与HSC的机械转导可导致肝纤维化 肝内细胞处于细胞外基质中，受到多种外界机械力的作用，如纤维蛋白的拉伸力、循环剪切力和肝窦扩张的张力均对肝内细胞功能有重要影响。LSEC损伤后，血管化反应诱导胶原纤维凝结，造成肝脏细胞周围基质硬度显著升高，诱导LSEC激活HSC。固定LSEC形态的实验发现，LSEC分泌的旁分泌因子并不能使HSC活化，即使两者直接接触，旁分泌因子也不足以激活HSC，表明LSEC所受机械力对于HSC激活和组织重塑必不可少[4]。因此，除生化转导途径外，LSEC与HSC之间的机械转导在肝纤维化过程中也起到重要作用。

在奥沙利铂引起的肝窦阻塞、肝窦重构等过程中，一方面，肝窦扩张可形成一种作用于窦周HSC的剪切力；另一方面，肝窦周围的局灶性再生增生可压迫肝窦导致形变，对HSC形成一种牵拉力，此外，在早期肝纤维化过程中，肝脏微环境中的纤维蛋白也可牵拉HSC，而肝脏硬度增加促进HSC活化的机制也可能与此有关。这些机械信号在HSC的活化及肝纤维化的进展中至关重要。Simonetto等[37]对HSC进行的拉伸实验表明，体外施加于HSC的拉伸力可以刺激HSC产生纤维蛋白，通过整合素β1/肌动蛋白依赖性机制促进纤维聚集。此外，敲减LESC中整合素β1基因可以抑制胶原重塑，表明LSEC可以通过整合素受体调节胶原纤维[4]。Martin等[38]发现，HSC中整合素β1的缺失导致了Yes关联蛋白1的下调，整合素β1/Yes关联蛋白1信号在介导HSC激活中具有关键作用。实验发现，Yes关联蛋白1敲低或Yes关联蛋白1抑制剂在体外可抑制较高硬度培养基条件下介导的HSC活化，并可减少由四氯化碳或胆管结扎引起的小鼠肝纤维化[39]。此外，使用p300抑制剂对转录共激活因子p300的破坏同样消除了较高硬度培养基诱导的HSC激活，从机制上讲，由较高硬度培养基介导的RhoA-蛋白激酶B机械信号诱导p300磷酸化，因此p300也启动了HSC的激活[40]。Liu等[4]通过体外模拟肝脏早期纤维微环境探究LSEC与HSC的相互作用发现，在140～610 Pa硬度的模拟基质上，LSEC形成了毛细血管状结构，模拟了肝纤维化早期的血管生成，并最终在活化HSC中观察到盘状结构域受体(discoidin domain receptor，DDR)2表达水平升高；进一步敲低HSC中DDR2并进行双向拉伸以替代LSEC的机械力发现，DDR2-KD阻止了拉伸状态下或早期肝脏纤维微环境中HSC的激活，同时JAK2、磷脂酰肌醇-3-激酶、蛋白激酶B的磷酸化水平均降低，HSC中纤维蛋白和α-平滑肌肌动蛋白表达减少。因此，LSEC毛细血管化诱导胶原纤维凝结，胶原重塑产生的力通过激活HSC中的DDR2-JAK2/磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B机械信号促进HSC活化。另外，HSC的膜受体DDR2通过与胶原纤维相互作用被激活，也可以促进HSC的增殖和迁移[41]。LSEC与HSC间的机械转导是近年研究的热点，除细胞间生化转导外，细胞间机械转导对肝纤维化病情进展亦起到重要作用，为肝纤维化的治疗提供了新的研究方向。

3 小 结

奥沙利铂通过损伤LSEC破坏了肝窦内壁的完整性，同时损害了肝窦自身的调节功能，导致以肝窦阻塞、扩张、重构等为主的一系列病理改变的出现，随后，HSC及其他肝内细胞发生炎症反应，通过细胞间相互作用激活HSC，而肝脏纤维化又与HSC的活化关系密切。在肝纤维化发生发展过程中，机械转导和肝脏中的生化信号传导同时存在，并在串扰的协同作用下，最终导致HSC激活，进而造成肝脏组织微环境改变，使肝纤维化发生，而肝纤维化很可能是导致奥沙利铂用药过程中药物敏感性下降的主要原因，但其具体机制仍需进一步证实。因此，如果将LSEC损伤作为病理改变的起点，HSC活化作为病理改变终点，在上述奥沙利铂与肝纤维化的作用机制中找到HSC激活途径的关键节点，通过靶向标记进行特异性诊断和干预治疗，可能达到早期诊断药物性肝脏损伤、阻止纤维化发生、提高药物敏感性、改善患者预后的目的。