苹果多倍体育种研究进展

常贝贝 张 硕 于晓丽 杜晓云 刘 伟 姜中武 赵玲玲

（1烟台大学生命科学学院，烟台 264005；2山东省烟台市农业科学研究院，烟台 265500；3山东省苹果·果业产业技术研究院，烟台 264003）

我国苹果属果树历史悠久，文字记载首次出现在西汉，记录在司马相如创作的 《上林赋》中，较详细的记载可以追溯至魏晋时期[1]。苹果已经成为世界上种植面积最大的果树树种之一，是我国主要消费果品之一，深受广大市民喜爱。目前育出的苹果品种多为二倍体，多倍体品种数量较少。而农业生产中，主要种植的农作物均为多倍体，如小麦为异源六倍体、马铃薯为同源四倍体、花生为异源四倍体、甘薯为同源六倍体等。由于多倍体品种性状表现优良，随着苹果产业的快速发展，生产上对优质品种的需求增加，开展多倍体品种培育研究显得尤其重要。

1 多倍体果树研究概况

多倍体是指含有三套或者三套以上完整染色体组的生物体，根据染色体组来源的差异，可分为同源多倍体和异源多倍体两种类型。很多植物在经染色体加倍后表现出植株强壮、生长旺盛、抗逆性强等特性，拥有此等优良性状的多倍体植物在自然界中普遍存在，多倍体是影响植物进化的重要因素，也是形成新品种的重要途径之一[2]。多倍体植株主要采用现代生物技术如组织培养技术对诱导的植株加以培养获得。目前被育种者们成功诱变出的多倍体果树已有很多种，如柿、山楂、猕猴桃、石榴、枣 、葡萄、梨、香蕉和苹果等。其中‘沾冬2号’是晚熟鲜食二倍体品种‘冬枣’自然变异中选育出的大果型、且拥有众多优良性状的新品种，经过鉴定为二、四混倍体[3]。 葡萄品种‘巨玫’‘玫瑰香’为四倍体，梨品种‘黄盖梨’为三倍体，山楂品种中‘大金星’为三倍体，桂林‘良丰无核柑’为二、四混倍体。当前培育的苹果品种主要为二倍体，三倍体品种为数不多，其主要品种类型有‘北海道’‘乔纳金’‘北斗’‘陆奥’等，而在少数品种中出现过四倍体类型，如‘金冠’和‘嘎拉’等，但是在栽培中应用较少。

2 多倍体产生途径

2.1 自然产生多倍体

果树中天然多倍体可分为苗期自然多倍体和自然芽变产生的多倍体。三倍体苹果品种‘大珊瑚’‘赤龙’‘绯之衣’等是从自然实生变异中选出的，这些三倍体品种可能都是通过2n配子途径产生的。‘大鸭梨’‘天海鸭梨’是‘鸭梨’的同源四倍体芽变。通过比对已经鉴定的40种苹果属植物，结果显示其二倍体品种多达30个，多倍体品种有10个，且以三倍体品种居多，四倍体和五倍体则相对较少。天然多倍体在其它果树中也广泛存在，如草莓生产上应用的主要栽培品种是八倍体，柿树、猕猴桃为六倍体。虽然多倍体在自然界中可通过加倍获得，但数量不多，随机性较强，且频率较低，在自然条件差的情况下，会出现不能生长甚至死亡的状况，在生产中获得大面积的应用和栽植比较困难。

2.2 有性杂交获得多倍体

苹果多倍体在自然界中实际存在已久，但通过自然突变获得完全四倍体的频率很低，且嵌合体严重。实践证明，二倍体之间杂交、二倍体和多倍体之间杂交的方法也可以获得多倍体。就苹果而言，许多多倍体品种都是通过二倍体品种间杂交育成，比如‘陆奥’‘乔纳金’‘世界一’‘北斗’等均是由二倍体与三倍体杂交获得。二倍体之间杂交虽然可以获得各种类型的多倍体，但出现多倍体的几率很低。除了苹果以外，其它果树品种，如梨、葡萄等多种果树也通过有性杂交途径成功获得多倍体品种。研究结果表明，由于产生的后代中亲本的优良性状易于丢失，通过有性杂交方式获得多倍体需要优质父本和母本作为杂交基础。

2.3 人工诱导多倍体

通过有性阶段和无性阶段均可产生多倍体，有性阶段是通过减数分裂过程中小孢子母细胞或大孢子母细胞不减数产生了2n配子形成多倍体，无性阶段则是体细胞分裂过程中通过染色体加倍且细胞不分裂形成多倍体。人工诱导多倍体主要有两种途径，分别为物理方法诱导和化学方法诱导。机械创伤、温度骤变和摘心处理等是为最常用的物理方法。在20世纪初期，使植物形成加倍的不定芽方法主要有嫁接、切伤、反复摘心法等，例如在番茄上，通过摘心实现多倍体诱导[4]，但其诱变率较低，定向性比较差，产生的嵌合体较多。目前这些物理方法诱导多倍体技术主要应用在一些具有营养繁殖优势的植物上。

化学方法是如今比较常用的诱变方法，一些化学试剂如乙烯亚胺、甲基黄酸乙酯、叠氮化合物、羟胺、抗生素、秋水仙素等等，均对植物分生组织有加倍效应。秋水仙素即秋水仙碱，是最常用的化学诱变试剂，熔点高达157℃，易溶于水、乙醇，味苦，有毒。1937年，Blakeslee等用秋水仙素诱导，使曼陀罗等植物的染色体数加倍且获得了成功。自此，秋水仙素便被作为培育植物新品种的主要诱变剂，为了提高诱变率，常常将诱变与叶片离体再生相结合。欧春青等[5]以试管苗叶片为外植体，用不同浓度秋水仙素处理‘寒富’苹果的离体叶片获得其同源四倍体植株，证明了叶片再生过程中想要获得四倍体，用秋水仙素处理是一个较为有效的途径。贾少桦[6]在叶片再生培养基中加入秋水仙素获得了‘珠美海棠’的四倍体植株。

3 多倍体的鉴定方法

3.1 形态学鉴定法

相较于二倍体而言，多倍体在形态学上的差异主要表现为巨大性，该特性是多倍体植株最为直观的外部形态特征，具体表现为高大的植株，茎干明显粗壮，根系发达，叶片明显肥厚，果实和花朵均明显增大等。马跃等[7]实验结果发现，经过秋水仙素诱导以后获得的同源四倍体植株相比二倍体植株，其叶片在形态上，更大、更厚。利用植株外部形态特征进行倍性鉴定，可直观的在苗期做出早期鉴定，大大减轻工作量，该方法的缺点是准确度不够高，误差大[8]。

3.2 染色体计数法鉴定

染色体计数法有常规压片法和去壁低渗法两种。

就压片法而言，一般情况下以根尖、茎尖、卷须、愈伤组织等为材料，经过醋酸洋红或苏木精等进行染色压片，然后在显微镜下对细胞分裂中期的染色体数目进行观察并计数，在此过程中需要比较熟练的操作技能。李林光等[9]使用压片法对多倍体植株进行了鉴定，经鉴定茎尖染色体数表明多半变异植株为同质四倍体。在某种程度上，该鉴定方法也有一定的缺点，如步骤太多，比较繁琐，要对需要鉴定的每株植株进行解离、染色、制片，并用显微镜仔细观察数出染色体具体数目，需要有较高的试验条件，对操作水平也有较高要求，否则容易在各个环节出现误差。

Gamage和 Schmidt[10]研制了一种新的染色体制片法，利用常规去壁滴渗法用DAPI染色和荧光显微镜检测相结合，能更清晰地看到染色体，适用于很多种木本植物，并已应用于柑橘，是较理想的直接鉴定方法。

3.3 流式细胞仪法鉴定

流式细胞仪越来越多地被应用于植物倍性鉴定。其鉴定原理是直接测定细胞的DNA含量，以此来快速鉴别植株的染色体倍性水平。这种方法操作步骤简单，且结果更为准确，已广泛应用于苹果等植物的倍性鉴定。流式细胞仪不仅可以检测单倍体和多倍体，还可以很准确地识别再生植物中的少量混合细胞和非整倍体细胞，避免传统检测方法不能全面的观察数量产生的检测误差。除此之外，该种方法不用考虑植物体取材部位以及细胞所处的时期，即叶片、茎、根、花、果皮、种子等均可以作为取材部位，而且所需材料较少，不影响植物的生长和发育。但此方法也存在一些弊端和不足，最大的问题是测定费用较高，对于一般育种单位来说在经济方面有一定的困难。目前，用流式细胞计数法已应用于大部分果树的倍性鉴定[11]。但这种方法只能准确鉴定出同质多倍体的数目，未知染色体数目的植物无法确定其染色体数，还需通过结合直接鉴定法进行鉴定，异源多倍体和有性杂交而得到的多倍体也无法确定其染色体来源。

4 问题与展望

近年来，通过苹果多倍体的选育，培育了众多优良品种，很大程度上丰富了我国的苹果种质资源。有关苹果多倍体的研究也越来越多，苹果多倍体育种的途径也多种多样。其中，最为常用的多倍体诱导技术是以不同浓度秋水仙素诱导苹果植株获得多倍体。此种方法操作简单，诱变率高，但此种方法不易获得纯合的苹果植株，容易出现嵌合体，性状分离现象较多。而嵌合体的纯化过程，费时又费力。通过离体胚状体途径是解决嵌合体纯化问题最为有用的方案，但是对于苹果而言，周期还是太长，因此，仍有必要继续探索新方法，以便短时间内更快地获得苹果多倍体。