胶质母细胞瘤中EGFRvⅢ及其靶向治疗研究进展

马亚光,龙宇，胡力，沈红，刘利，林志国

(哈尔滨医科大学附属第一医院神经外科四，哈尔滨 150001)

胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)是最常见的恶性原发性脑肿瘤，约占所有胶质瘤的57%，占所有原发性恶性中枢神经系统肿瘤的48%[1]。其预后差，复发率高，生存率低，5年生存率为4%～5%[2]。目前，GBM的有效治疗方法仍为手术切除，术后再辅助放疗、化疗、免疫治疗、光动力治疗、电场疗法等，效果不理想。鉴于目前的有效治疗方式，靶向治疗可以作为GBM的有效治疗策略之一。

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)在不同的癌症中常高水平表达，且其表达水平与癌症进展和不良预后呈正相关，EGFR的不同突变形式会导致癌症的异质性[3]，最常见的为表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(epidermal growth factor receptor variant Ⅲ，EGFRvⅢ)，EGFR的突变常见于GBM，其中EGFRvⅢ在中GBM的编码突变率约为50%，且高达28%～30%的GBM细胞上特异性存在EGFRvⅢ[4-5]。另有研究证明，EGFRvⅢ阳性患者生存期较短[6]。EGFRvⅢ在25%～30%的GBM中表达，且只能在肿瘤组织细胞表达，这可能是EGFR基因扩增重排最常见的结果[7]。然而，GBM的靶点机制尚不明确，导致相关靶向性治疗效果不明显。鉴于EGFRvⅢ在GBM的生长中起促进作用，现就GBM中EGFRvⅢ及其靶向治疗研究进展予以综述。

1 EGFR的分子结构功能

EGFR是一种分子量为170 000的跨膜蛋白，属于酪氨酸激酶受体家族[8]。酪氨酸激酶受体家族成员具有相似的结构，包括：①具有两个富含半胱氨酸区域的胞外结构域；②单个跨膜区域；③含有多个酪氨酸的胞质结构域。EGFR由表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)家族的成员激活，包括EGF、双调蛋白、转化生长因子-α、肝素结合性表皮生长因子和上皮调节蛋白[9]。这些因子的结合参与细胞分裂、存活及细胞死亡的磷酸化级联反应和下游途径信号转导。EGFR家族是一个复杂的系统，参与生长因子细胞信号传递。在质膜上，EGFR的磷酸化通过识别和结合Src同源区2和磷酸酪氨酸结合结构域到受体上的磷酸酪氨酸基序，导致多种效应蛋白的募集。EGFR可以参与和调节许多信号通路，如磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)、RAS/促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和Janus激酶(Janus kinase，JAK)2/信号转导及转录激活因子(signal transduction and activator of transcription，STAT)[10-11]。在正常细胞中，EGFR通过配体诱导的受体二聚化和酪氨酸自磷酸化在GBM的细胞增殖中起作用。在肿瘤中，EGF与配体结合后通过受体磷酸化而激活受体酪氨酸激酶/RAS/PI3K通路，该信号通路的激活能促进肿瘤细胞增殖、血管生成和对局部组织侵袭[12]。

2 EGFRvⅢ在GBM中的形成机制

EGFR基因位于人类染色体7p11～13上，长度约110 Kb。在GBM中，EGFR缺失包括EGFRvⅠ缺失(N端缺失)、EGFRvⅡ缺失(外显子缺失14～15)、EGFRvⅢ缺失(外显子缺失2～7)、EGFRvⅣ缺失(外显子缺失25～27)、EGFRvⅤ缺失(外显子缺失)[13]。在GBM中，最常见的为编码野生型EGFR及其突变体EGFRvⅢ的扩增。EGFRvⅢ突变导致野生型EGFR基因外显因子2和7间801个碱基对的缺失，最终使胞外结构域的6～273个氨基酸产生框内截断，影响氨基酸二聚化及与配体的结合，因而不具有与EGF结合的能力[14]。这种突变在肿瘤表面形成特异性抗原表位，EGFRvⅢ的这种特性能有效避免在治疗过程中对正常脑组织损害，故使其成为潜在治疗靶点。EGFRvⅢ能够在GBM中表达，还可能与野生型EGFR DNA扩增相关，其能将突变基因转移到缺乏这种改变的细胞中[15]；具有扩增子的细胞实验显示，具有突变的细胞经过染色体外DNA元素感染结果表明细胞中缺乏扩增子，导致EGFRvⅢ中的细胞表达为阳性，继续维持细胞生长[16]。研究证明，EGFRvⅢ仅在肿瘤表达，在正常组织中无法检测到，因此EGFRvⅢ可以作为精准靶点药物治疗的选择对象[17]。

3 EGFRvⅢ表达与GBM的关系

根据世界卫生组织胶质瘤分级，GBM属于Ⅳ级，恶性程度最高。在GBM中，约60%为原发性，其余则由低级别脑胶质瘤经恶性转化而来。Yang等[18]通过研究EGFRvⅢ对中国人脑胶质瘤预后的影响发现，在240例胶质瘤患者中有73例检测到EGFRvⅢ表达(中度阳性和强烈阳性)，且EGFRvⅢ的表达率越高，阳性程度越强，表明胶质瘤级别与ERFGvⅢ表达水平呈正相关。此外，肿瘤细胞侵袭和迁移不可避免地依赖或释放基质成分，均与基质降解蛋白酶的蛋白水解酶活性增加有关，且它们在胶质瘤中上调均与EGFR和EGFRvⅢ的上调有关，如EGFRvⅢ的表达与基质金属蛋白酶9的表达密切相关，因为EGFRvⅢ可通过激活胶质瘤细胞中的胞外信号调节激酶(extracellular singal-regulated kinase，ERK)增加基质金属蛋白酶9的表达来促进胶质瘤细胞的侵袭性。

4 EGFRvⅢ介导的信号通路参与GBM发生的机制

4.1PI3K/Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路 PI3K/Akt/mTOR信号通路在促进肿瘤细胞增殖、凋亡、自噬和代谢中起关键作用[19]。该信号通路激活能使磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸磷酸化为磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸，并进一步激活Akt和mTOR。激活的mTOR复合物2能通过磷酸化作用激活Akt信号通路，同时失去人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因主要抑制因子，失去抑制因子的Akt信号通路无法阻止磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸的去磷酸化进行负反馈调节PI3K/Akt通路，导致Akt信号通路在细胞质中无法重新定位，从而再一次激活Akt和mTOR[20-21]。另外，PI3K具有独立p85调节亚基家族性激酶异二聚体，通过p85-p110复合物或RAS直接或间接激活PI3K/Akt通路[19]。而EGFRvⅢ参与该信号通路，因为EGFRvⅢ具有配体和非依赖性酪氨酸激酶能够以自磷酸化的方式激活PI3K，激活后的PI3K进一步磷酸化Akt蛋白，激活Akt依次磷酸化下游通路分子，以调节代谢、细胞生长、血管生成、运动和凋亡[6]。

4.2JAK/STAT信号通路 在GBM中，EGFRvⅢ在通过JAK-STAT信号通路促进GBM形成机制中起重要作用。当STAT被JAK磷酸化时，非活性胞质STAT单体胞质发生构象变化，形成活性同二聚体、异二聚体或四聚体，激活的STAT可以转移到细胞核中，作为转录因子来调节基因表达[22-23]。研究发现，EGFRvⅢ不能结合EGF配体或被EGF配体激活导致EGFR磷酸化，磷酸化的EGFRvⅢ被转移到细胞核中形成一个复合物，从而增强STAT3的磷酸化；同时，该研究还发现野生型EGFR和EGFRvⅢ细胞中的共同表达表型能增加STAT3和STAT5的磷酸化，并通过促进肿瘤免疫抑制环境的形成，使其共同表达肿瘤恶性程度明显高于单一受体表型[14]。可见，EGFRvⅢ不仅具有促进肿瘤细胞自我更新、增殖和侵袭的作用，还起到肿瘤免疫抑制作用。

4.3RAS/MAPK/ERK信号通路 在所有信号网络通路中，ERK是MAPK的家族成员，其是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是一种传递丝裂原的信号传递蛋白，而ERK/MAPK信号通路是调节细胞生长、发育和分裂的核心[24]。由于EGFRvⅢ胞外域的缺失，其不能与EGF结合，仅能结合含有Src同源区2结构域的生长因子受体结合蛋白2，促进RAS蛋白激活，激活的RAS驱动RAF-MAPK/ERK信号级联，同时信号通路中的ERK激活反过来磷酸化大量下游底物并转移到细胞核中，以调节一系列蛋白质和转录因子活性，促进肿瘤细胞生长[25-26]。

4.4Src家族激酶(Src family kinase，SFK)信号通路 研究发现，SFK、Fyn和Src是致癌EGFR信号的效应因子，这些效应因子能够增强肿瘤细胞的侵袭和在体内的存活，而EGFRvⅢ的表达导致酪氨酸磷酸化的激活，促进肿瘤的生长和运动[27]。EGFRvⅢ(也称为de2-7EGFR)在GBM中常与EGFR共同表达，它通过SFK依赖的Dock180磷酸化促进肿瘤发生，Dock180是Rac1鸟嘌呤核苷酸交换因子，可激活Rac1，参与调节细胞运动和侵袭。同时，EGFRvⅢ还可诱导酪氨酸残基722位点Dock180磷酸化，并刺激Rac1信号转导，导致GBM细胞存活和迁移[28]。

5 EGFRvⅢ参与GBM的靶向性治疗

目前，通过了解EGFR/EGFRvⅢ在GBM中的发生机制，已将EGFR/EGFRvⅢ作为一个理想的靶点，且针对EGFR/EGFRvⅢ靶点研制出多种治疗方法，包括EGFR/EGFRvⅢ小分子抑制剂治疗、EGFR/EGFRvⅢ抗体治疗、EGFR/EGFRvⅢ介导相关疫苗治疗、嵌合抗原受体T细胞免疫治疗(chimeric antigen receptors T-cell immunotherapy，CAR-T)等。

5.1EGFR/EGFRvⅢ小分子抑制剂治疗 EGFR在肿瘤细胞增殖、侵袭和抗凋亡中起重要作用，其在GBM中发生扩增和表达；EGFRvⅢ是EGFR的一种活跃突变形式，驱动GBM亚群生长，使小分子靶向治疗成为有效治疗方案[29]。其中，第一代药物EGFR抑制剂被设计为原位阻断酪氨酸激酶结构域内EGFR/ATP结合位点，阻断EGFR激活，代表药物有吉非替尼、埃罗替尼和拉帕替尼[30]。由于酪氨酸激酶结构外显子的突变不存在GBM患者中，故第一代药物治疗效果不明显[10]。第二代药物EGFR-酪氨酸激酶抑制剂被设计为不可逆的EGFR与其他ERBB家族成员酪氨酸激酶结合，代表药物有阿法替尼，但目前关于第二代药物治疗GBM患者的有效剂量仍需进一步临床试验验证[31-32]。第三代药物是一种不可逆抑制剂，具有抗EGFR突变体(T790M、L858R、外显子19活性缺失)，同时保留野生型EGFR[33]。如第三代药物罗西替尼正在进行临床试验，虽然T790M突变在GBM患者中并不常见，但仍可以作为一个备选靶点基因[34]。

5.2EGFR/EGFRvⅢ抗体治疗 与野生型EGFR相比，EGFRvⅢ由于配体结合域缺失突变，其对L2结构域抗体不敏感[35]。目前，临床批准针对EGFR的抗体包括西妥昔单抗、帕尼单抗和尼妥珠单抗。EGFRVⅢ靶向抗体包括西妥昔单抗、奈昔拖珠单抗、尼妥珠单抗，这些单抗均不能抑制EGFRvⅢ的激活，而帕尼单抗是唯一能够同时消除EGFRvⅢ和野生型EGFR的抗体，导致p-S6信号通路受到抑制，从而在体内外具有抗肿瘤活性[36]。由于血脑屏障作用，EGFR/EGFRvⅢ抗体治疗GBM仍面临严峻挑战。

5.3EGFRvⅢ介导相关疫苗治疗 抗GBM疫苗(如Glio Vac)是一种灭活肿瘤细胞的复合物[37]。目前针对以EGFRvⅢ为靶点学者研究出主动和被动免疫的特异性疫苗，其中多肽疫苗在治疗肿瘤过程中发挥免疫作用[38]。EGFRvⅢ是一种肿瘤抗原，且仅表达于肿瘤组织中，其能够成为主动免疫治疗的目标。ridopepimut(CDX-110)是经过EGFRvⅢ氨基酸序列重新连接合成的由14-聚体肽组成的多肽疫苗，可以诱导EGFRvⅢ特异性的体液和细胞免疫应答，该疫苗的特异性可能与EGFRvⅢ在GBM细胞上的独立表达有关[39]。由于ridopepimut的有效性和安全性，其能够成为一个极具前景的GBM治疗策略。

5.4CAR-T 嵌合抗原受体是人工融合蛋白，包括细胞外抗原识别域、跨膜域和细胞内T细胞信号域。CAR-T是通过对T细胞进行修饰，导致T细胞表达肿瘤抗原的嵌合抗原受体，从而特异性识别肿瘤抗原，清除癌细胞，达到临床缓解并根治肿瘤的目的[40]。在小鼠模型中，以EGFRvⅢ突变为靶标的嵌合抗原受体能够识别并消除表达其靶点的细胞[41]。另一项Ⅰ/Ⅱ期试验显示，在表达EGFRvⅢ的恶性胶质瘤患者中，使用嵌合抗原受体T细胞与抗EGFRvⅢ人139-scFv、CD28和4-1BB共同刺激结构域，结果显示CAR-T无任何不良反应[42]。一项测试利用嵌合抗原受体治疗以EGFRvⅢ为靶点的GBM患者，结果显示其能够提高患者生存率[40]。另有研究显示，在胶质瘤模型中发现嵌合抗原受体修饰免疫细胞能够穿透血脑屏障，为GBM患者提供潜在的治疗方案[43]。

5.5双特异性T细胞衔接器(bispecific T-cell engagers，BiTEs)治疗 BiTEs是一种通过基因工程改造的融合的二价单克隆抗体，可与两个不同抗体的单链可变片段相互作用：一种抗体片段与T细胞结合，另一个片段与肿瘤细胞的抗原结合，同时结合肿瘤细胞上的抗原和T细胞上的表面分子来诱导肿瘤溶解[44]。Gardell等[45]研究发现，通过筛选巨噬细胞分泌一种病毒编码，针对功能性靶向性EGFRvⅢ的BiTE蛋白，能够诱导T细胞活化、增殖、脱颗粒和杀死抗原特异性肿瘤细胞。AMG 596是一种BiTEs免疫肿瘤治疗方法，它由两个单链可变片段组成，通过两个单链可变片段与GBM细胞上的肿瘤特异性抗原、EGFRvⅢ和T细胞上的CD3结合，从而激活T细胞增殖和分泌细胞毒性物质，诱导肿瘤细胞溶解[46]。虽然BiTE治疗神经胶质瘤的应用尚未进入临床试验，但其抑制肿瘤的作用得到进一步证实。

6 小 结

EGFRvⅢ独特的分子结构及相关信号网络通路为GBM的治疗提供新靶点，目前随着分子生物学发展，EGFR和EGFRvⅢ在GBM的作用中得到有效的验证。虽然对EGFR信号通路的理解取得明显进步，但是针对EGFR和EGFRvⅢ的治疗未显示明显临床获益。且复杂的信号调控网络、低效率的血脑屏障穿透、肿瘤的异质性和次级突变增强了GBM的耐药性。EGFRvⅢ靶向治疗可能能有效杀死EGFRvⅢ阳性的肿瘤细胞，但那些残存下来的肿瘤细胞仍然依赖EGFR，应采取新的组合疗法针对多个靶点进行治疗。因此，未来应全面了解EGFRvⅢ的分子结构及相关信号网络通路，以为GBM提供更有效的联合治疗方案。