木霉菌对马铃薯黑痣病菌的拮抗作用及防效研究

王天君，陈志垚，杨霞，于广宇，台莲梅,2

（1．黑龙江八一农垦大学农学院，大庆 163319；2．黑龙江省作物-有害生物互作生物学及生态防控重点研究室）

马铃薯黑痣病也被称为茎基腐病[1]，是由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的可以导致马铃薯减产和降低品质的土传病害[2]。东三省作为我国马铃薯主产区对马铃薯黑痣病已有报道[3]。根据调查显示，黑痣病发生严重地块的植株死亡率可达70%以上，块茎基本全部发病[4]。该病害发生严重时,能够造成马铃薯减产过半[5]。病原菌通过侵害幼芽、匍匐茎和根形成褐色坏死斑影响植株生长，菌丝聚集在块茎表面形成的菌核即为“黑痣”[6]。黑痣病的防控已成为我国马铃薯生产中面临的重要问题之一。一直以来，马铃薯黑痣病的防控主要采取化学防治、抗病育种和农业防治等方法[7-9]。化学防治造成农药残留和环境污染且防治效果不理想。抗病品种的选育进展缓慢，且在马铃薯种质资源中未发现高抗品种。农业防治可以辅助防病但不能从根本上控制该病害。生物防控可作为解决土传病害的有效途径，木霉菌（Trichoderma spp.）作为一种生物防治植物病害的有益真菌，在农业生产实践中起到了显著的作用和效果，开始被人们广泛讨论[10-12]。目前利用木霉菌防治作物病害的报道中，对于防治马铃薯黑痣病菌的报道很少，同时木霉菌种类很多，不同种之间以及同种的不同菌株之间对病菌的抑制作用存在明显差异[13-14]。筛选对马铃薯黑痣病菌有较强抑制作用的木霉菌株，将对马铃薯黑痣病的生物防控具有重要意义。研究旨在研究不同木霉菌对黑痣病菌的拮抗作用，筛选出对黑痣病菌抑制效果好的木霉菌，从而为马铃薯黑痣病的防治和木霉菌剂的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

病原菌菌株：马铃薯黑痣病菌-立枯丝核菌（Rhizoctonia solani），黑龙江八一农垦大学植物病理研究室保存。

木霉菌株：木霉菌（Trichoderma spp.）由黑龙江八一农垦大学植物病理研究室保存，供试菌株共17株，分别为棘孢木霉（Trichoderma asperellum）、黑绿木霉（T.atroviride）、交织木霉（T.intricatum）、钩状木霉（T.hamatum）、哈茨木霉（T.harzianum）1、哈茨木霉（T.harzianum）22、绿色木霉（T.viride）1、绿色木霉（T.viride）2、绿色木霉（T.viride）3、长枝木霉（T.longibrachiatum）1、长枝木霉（T.longibrachiatum）2、长枝木霉（T.longibrachiatum）38、长枝木霉（T.longibrachiatum）115、拟康宁木霉（T.pseudokoningii）1、拟康宁木霉（T.pseudokoningii）19、拟 康 宁 木 霉（T.pseudokoningii）20、拟康宁木霉（T.pseudokoningii）78。

1.2 试验仪器

主要仪器：MLS-3781L-PC立式压力蒸汽灭菌器、SPX-400智能生化培养箱、Olympus BX60多功能显微镜、KXV-1210全温水平摇床。

1.3 试验方法

1.3.1 不同木霉菌菌丝生长速度的测定

在90 mm的培养皿底部的背面画上“十”字，将在PDA平板上活化培养3 d的17株木霉菌菌碟（φ6 mm）接种在PDA培养基上，每个处理4次重复，28℃恒温培养48 h后用十字交叉法测量菌落的直径[15]。

1.3.2 不同木霉菌产孢量的测定

将直径为6 mm的木霉菌碟接种在PDA培养基上培养5 d。5 d后向培养的木霉菌株中加入10 mL无菌水反复冲洗，将洗下的孢子悬浮液置于试管中依次稀释，用血球计数板于显微镜下观察进行孢子计数，每个处理4次重复[16]。

1.3.3 不同木霉菌与立枯丝核菌空间竞争能力测定

采用对峙培养法[17]，在90 mm的PDA平板两端，取直线距离为60 mm的上下两点，分别接种培养3 d的立枯丝核菌和木霉菌菌碟，以只接立枯丝核菌放置于培养皿上点作对照，于28℃下恒温对峙培养，每个处理4次重复，待木霉菌与立枯丝核菌接触后计算木霉菌对立枯丝核菌菌丝生长抑制率（%）。对峙抑制率（%）=（对照菌落半径－处理菌落半径）/对照菌落半径×100。

培养7 d后，采用拮抗指数评价竞争作用强弱。拮抗指数分级标准为：Ⅰ级，木霉菌丝占据平皿100%；Ⅱ级，木霉菌丝占据平皿＞2/3；Ⅲ级，木霉菌丝占据平皿＞1/3，＜2/3；Ⅳ级，木霉菌丝占据平皿＜1/3；Ⅴ级，病原菌占据平皿100%。

1.3.4 不同木霉菌对立枯丝核菌重寄生作用

在无菌载玻片上涂抹l mm厚的PDA培养基，再将4 mm×4 mm立枯丝核菌和木霉菌的菌块接种在载玻片两端，相距2 cm，每个处理4次重复，28℃恒温培养24～36 h，待木霉菌与立枯丝核菌菌丝接触后用光学显微观察并拍照记录。

1.3.5 不同木霉菌固体培养挥发性代谢物对病菌抑制作用

（1）木霉菌易挥发代谢物对立枯丝核菌的拮抗作用

采用对扣培养法测定[18]。将木霉菌接种在PDA培养基上28℃恒温培养2 d，并用无菌的双层赛璐玢膜盖在其上方，接着用刚接过立枯丝核菌的培养基倒扣在赛璐玢膜上，用封口膜进行密封。把病原菌倒扣于未接种过木霉菌的PDA上作为对照，每个处理4次重复。28℃恒温培养48 h，测量立枯丝核菌菌落直径，并计算木霉菌挥发代谢物对立枯丝核菌的抑制效果。菌丝生长抑制率（%）=（对照菌落直径－处理菌落直径）/对照菌落直径×100。

（2）木霉菌难挥发代谢物对立枯丝核菌的拮抗作用

采用圆盘滤膜法测定[19]。将赛璐玢膜平铺在PDA平板上，其上接种木霉菌碟，28℃恒温培养2 d后移去赛璐玢膜，其后接种活化3 d的病原菌菌碟，以只接种立枯丝核菌菌碟作对照。每个处理4次重复，28℃恒温培养箱内培养。48 h后测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率。计算方法同上。

1.3.6 不同木霉菌液体发酵滤液对立枯丝核菌的抑制作用

在100 mL PD培养液中接入10个直径6 mm的木霉菌碟，28℃、150 r·min-1恒温黑暗震荡培养7 d后，用直径0.22μm的无菌过滤器过滤除菌，获得无菌发酵滤液[20]。分别将10 mL和30 mL的滤液与无菌PDA混合至100 mL，制成含有10%和30%发酵液PDA平板。将立枯丝核菌菌碟接种于发酵液PDA平板上，28℃恒温培养，以分别混合等量无菌水的PDA平板上接病原菌作对照，每个处理4次重复。接菌后72 h测定菌落直径并计算抑制率，计算方法同上。

1.3.7 木霉菌剂对马铃薯黑痣病的盆栽防治作用

木霉菌剂制备[21]：拟康宁木霉78的菌液与无菌发酵基质（麦麸）以1∶4（V/W）的比例均匀混合在无菌磁盘上，于28℃恒温培养箱中恒温培养5~6 d，待木霉长满磁盘后放置于室温下晾晒2~3 d，晒干后于粉碎机中打碎制成木霉菌剂备用。盆栽试验共设置5个处理：（1）空白对照；（2）0.6%发酵基质：0.6 kg发酵基质与100.0 kg薯块充分混拌；（3）0.6%木霉菌剂：0.6 kg木霉菌剂与100.0 kg薯块充分混拌；（4）1.0%木霉菌剂：1.0 kg木霉菌剂与100.0 kg薯块充分混拌；（5）1.0%复合菌剂：1.0 kg复合菌剂（木霉菌剂：腐殖酸=3∶2）与100.0 kg薯块充分混拌。立枯丝核菌液以1.0%的施用量（V/W）均匀拌入盆栽土中，每盆种植4株马铃薯，每个处理15个重复。种植30 d后调查黑痣病发生情况。

马铃薯黑痣病的分级标准采用Weinhold[22]的方法，发病率、病情指数和防治效果按下式计算。发病率（%）=（发病株数/调查总株数）×100；病情指数=[∑（发病株数×发病级别）/（调查总株数×5）]×100；防治效果（%）=（空白对照病情指数-处理病情指数）/空白对照病情指数×100。

2 结果与分析

2.1 不同木霉菌菌丝生长速度与产孢能力

17株供试木霉菌生长速率差异显著，其中长枝木霉115的菌丝生长速率最快，菌落直径为76 mm。不同木霉菌株产孢量差异非常明显，其中棘孢木霉、绿色木霉3、拟康宁木霉78和哈茨木霉22的产孢量最大，分别为3.68×109、2.88×109、2.20×109·mL-1和1.58×109·mL-1。同种木霉菌的不同菌株菌丝生长速率相近，但产孢量差异较大。如拟康宁木霉19和拟康宁木霉20，培养2 d的菌落直径分别为69、67 mm，产孢量分别为5.65×107、4.37×105·mL-1（表1）。

表1 不同木霉菌株生长速率和产孢能力Table 1 Effects of growth rate and sporulation quantity of different Trichoderma spp.

2.2 不同木霉菌与立枯丝核菌空间竞争能力

平板对峙试验显示，17株木霉菌对立枯丝核菌均有明显抑制作用（表2）。其中交织木霉、长枝木霉2和绿色木霉2对立枯丝核菌的抑制率最高，均达到74.0%以上。拮抗指数表明，拟康宁木霉78、哈茨木霉22、拟康宁木霉19、长枝木霉38、棘孢木霉的拮抗能力最强，拮抗指数均为Ⅰ。与对照的立枯丝核菌菌落相比，随着木霉菌的生长，立枯丝核菌菌丝生长速度开始变慢，与木霉菌接触后菌落颜色变浅，菌丝开始被消解变得稀疏，说明木霉通过空间和营养竞争可以抑制立枯丝核菌生长（图1）。

表2 平板对峙木霉菌对立枯丝核菌的抑制作用Table 2 Inhibition effect of Trichoderma spp.on R.solani by Plate confrontation cultivate

图1 不同木霉菌对立枯丝核菌的平板对峙Fig.1 Plate confrontation of different Trichoderma spp.on R.solani

2.3 不同木霉菌对立枯丝核菌的重寄生作用

对生长速率快、产孢量高及平板对峙抑制效果好的8株木霉菌进行重寄生显微观察发现，8株木霉菌对立枯丝核菌均有重寄生现象（图2b~2i）。木霉菌在接触到病原菌的时候，其菌丝开始分化出更多的菌丝分支并缠绕在病菌的菌丝体上，随着时间的观察，立枯丝核菌被缠绕的部分菌丝收缩，变形和断裂，供试的8株木霉菌株在与病原菌的对峙培养中均观察到木霉菌丝盘旋环绕在丝核菌上。

图2 不同木霉菌对立枯丝核菌的重寄生作用Fig.2 Parasitism action of different Trichoderma spp.on R.solani

2.4 固体培养不同木霉菌的代谢物对立枯丝核菌的抑制作用

同种木霉菌易挥发性代谢物对病原菌的抑制效果明显不同（表3），其中长枝木霉115产生的挥发性代谢物质对病原菌的抑制率最高为53.4%，与长枝木霉2（抑制率为37.5%）差异显著，其他木霉菌株对病原菌的抑制率差异不明显。8株木霉菌产生的难挥发性代谢物对病原菌的抑制作用较强，抑制率均高于80%。其中绿色木霉2与长枝木霉38菌株的抑菌率最高，达到100.0%，其次为拟康宁木霉78，抑制率为90.8%，与其他木霉菌株差异显著。

表3 固体培养不同木霉菌挥发性代谢物对立枯丝核菌的抑制作用Table 3 Inhibition of different volatile metabolites of Trichoderma spp.in solid culture on R.solani

2.5 不同木霉菌液体发酵滤液对立枯丝核菌的抑制作用

由表4可知，不同木霉菌发酵滤液对立枯丝核菌均有抑制作用。PDA平板含木霉菌发酵滤液浓度为10%时，抑制率较低，其中对立枯丝核菌菌丝的抑制效果最好的是拟康宁木霉78的发酵滤液，抑制率高达65.9%。PDA平板含木霉菌发酵滤液浓度为30%时，其代谢物对病原菌的生长产生明显的抑制作用，供试的8株木霉菌对病原菌的抑制率为64.3%～92.9%，其中，拟康宁木霉78对病原菌的抑制率高达92.9%，和其他7株木霉菌有显著差异，其次，对病菌抑制效果较好的木霉菌株是长枝木霉38、长枝木霉115和拟康宁木霉19，抑制率为81.0%～88.1%。

表4 不同木霉菌发酵滤液对立枯丝核菌的抑制作用Table 4 Inhibition effect of different Trichoderma spp.fermentation filtrates on R.solani

2.6 木霉菌剂对马铃薯黑痣病的盆栽防治效果

木霉菌剂对马铃薯黑痣病的盆栽防治试验结果表明，施加木霉菌剂的不同处理能在一定程度上控制马铃薯黑痣病的发生（表5）。0.6%发酵基质的发病情况较空白对照差异不明显，说明施入的基质量对病害发生的影响不大。随着木霉菌剂剂量增加，对马铃薯黑痣病的防效逐渐增强，0.6%木霉菌剂和1.0%木霉菌剂的防效分别为59.07%和67.38%。1.0%复合菌剂防病效果最强，防效为70.11%，显著高于单施木霉菌剂，说明木霉菌剂与腐殖酸混合更能降低黑痣病的发生程度。

表5 木霉菌对马铃薯黑痣病的盆栽防治效果Table 5 The pot control effects of Trichoderma on potato black scurf disease

3 讨论

木霉菌对丝核菌的拮抗机制存在多种形式，不同木霉菌种之间对病菌的抑制作用存在明显差异。在前期研究中发现，同种木霉菌菌丝生长速率相近，但不同菌株之间产孢量却产生较大差异。同时也发现哈茨木霉22、拟康宁木霉78、长枝木霉38、棘孢木霉、拟康宁木霉19与立枯丝核菌的对峙试验中表现出较强的空间竞争能力与营养夺取力，既抑制立枯丝核菌在同一条件下的生长速率，又进一步在立枯丝核菌菌落上增加了木霉菌菌落面积，导致病原菌菌落缓慢消失。木霉菌对立枯丝核菌重寄生下的显微观察，所有的木霉菌菌丝都能以盘旋环绕的方式在立枯丝核菌菌丝上，并在病原菌菌丝上产生小的分支菌丝再次进行缠绕，推测这些细小分支可能侵入病原菌菌丝内部，从而导致病原菌菌丝的变形，断裂，至其最终解体死亡，与田连生等[23]研究认为木霉菌对草莓灰霉菌的拮抗主要依靠竞争作用和重寄生作用的机理一致。通过固体平板培养，8株木霉菌产生的易挥发代谢物对病原菌的抑制率较低，而木霉菌产生的难挥发代谢物对病菌有较强抑制作用，说明木霉菌对病菌的抗生物质主要是一些难挥发代谢物质。用木霉菌液体发酵滤液进行抗生拮抗作用试验，结果表明，8株木霉菌对立枯丝核菌均有较强的抑制作用，进一步证明了抗生作用是木霉菌对病原

菌的重要抑制作用之一。盆栽试验结果证明，拟康宁木霉78能有效防治马铃薯黑痣病，其中，复合木霉菌剂较单施木霉菌剂防病效果好，可能腐殖酸能激发其生防潜能或提高植株的抗病性，其机理有待于进一步研究。

4 结论

木霉菌可以通过竞争、重寄生和抗生作用抑制马铃薯黑痣病菌。不同木霉菌株在各种拮抗机制中对病菌表现拮抗作用强弱不完全一致，根据生长速度、产孢量及对病菌的拮抗作用综合分析确定拟康宁木霉78对马铃薯黑痣病菌的拮抗作用最好。其菌剂盆栽防效为59.07%～70.11%。研究为开发木霉菌剂对马铃薯黑痣病的防治奠定了基础。