山东地区1例肉鸡养殖场大肠杆菌噬菌体的分离和解谱鉴定

魏甜甜

（青岛市即墨区畜牧业发展服务中心，山东青岛 266200）

大肠杆菌是引发鸡肠道疾病的主要致病菌，严重危害畜禽健康，影响畜禽产量和质量，给养殖业带来巨大的损失[1～3]。随着细菌耐药谱不断扩展，研究畜禽新型抗菌药物对解决耐药性问题至关重要。噬菌体治疗有明显的优势，未来对其应用价值的研究将会成为畜禽抗菌药物研究的重点。

本试验以从山东地区某肉鸡场发病肉鸡体内采集的24株致病性大肠杆菌为宿主菌，从垫料中分离噬菌体，并检测分离到的噬菌体的裂解谱，选取其中的宽噬噬菌体进行保存及研究，为治疗鸡源大肠杆菌病奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病料采集

菌种：山东地区某肉鸡场发病肉鸡体内采集的24株致病性大肠杆菌为宿主菌。

1.2 方法

1.2.1 复苏培养菌种

用细菌接种环分别挑取适量-20℃甘油冻存的24株致病性大肠杆菌菌液，在SS琼脂培养基上分区划线分离单个菌落，将培养皿倒置于37℃恒温箱中培养16～24 h。

制备菌悬液：在已灭菌的超净台上，分别挑取粉红色单个菌落，接种到5 ml营养LB肉汤的试管中，于空气浴振荡器37℃ 200 rpm过夜培养得菌悬液，置于4℃冰箱内保存备用。

制备混合菌悬液：分别从已培养好的5 ml菌悬液中各取100 μl菌液加入到盛有 LB肉汤20 ml的三角瓶中，空气浴振荡器37℃200 rpm振荡培养6 h得混合菌悬液，4℃保存备用[4]。

1.2.2 处理垫料

将垫料5g加入生理盐水10 ml中，并用玻璃棒搅拌至均匀，呈糊状备用（有条件的可以用筛粪器将其中杂质筛除）。

1.2.3 噬菌体的分离与鉴定

制备噬菌体增殖液：取垫料2 g加入上述混合菌悬液中，充分混合均匀，于空气浴振荡器中37℃ 160 rpm培养10 h，用于噬菌体的分离培养。

本试验采用双层平板法对分离到的噬菌体进行鉴定，将已配好2%的底层琼脂熔化后冷却至50℃左右，倾注入无菌培养皿中，待凝固后倒置以备用。

将上述噬菌体增殖液静置20 min后，取出15 ml 10000 rpm离心5 min，将其中的上清液用无菌针头式滤器过滤除去细菌碎片，得到无菌滤液，将得到的滤液装于EP管中备用。各取100 μl菌悬液分装于24个EP管中，再各加上100 μl上述滤液，用力振荡使菌悬液与噬菌体滤液充分混匀后，40℃水浴15 min，再将所得的混合液立即加入到已融化好的上层营养琼脂中（55℃），用手快速搓试管使混合悬液与上层琼脂混匀后，快速对号倒入已凝固好的底层琼脂平板上，旋转平皿轻摇平板使上层营养琼脂分布均匀，待上层营养琼脂凝固后，倒置放入37℃的恒温培养箱培养3～5 h后，第一次观察有无噬菌斑，观察完毕后，再次培养至6～8 h，第二次观察有无噬菌斑及其噬菌斑的大小形态。结果表明，如果滤液中存在着噬菌体，既可在平板上形成蚕蚀状的空斑，与灰白色的菌苔形成对比，即为噬菌斑[5～6]。

1.2.4 噬菌体的纯化

通过双层平板法我们可以在平板上得到肉眼可见，大小不一，形态各异，圆形、清晰、透明的噬菌斑。因此，需要对分离到的噬菌体进行纯化。操作过程如下：将镊子在酒精灯上灭菌，待冷却后，挑取单个噬菌斑置于盛有1 ml无菌生理盐水的EP管中，40℃水浴30 min后4000 rpm离心10 min，取出上清得到噬菌体的浸出液继续采用双层平板法。重复上述步骤3～5次，得到大小均匀一致、透明的噬菌斑。

1.2.5 噬菌体的增殖

通过双层平板法得到的噬菌体的效价很低，需要进行噬菌体的增殖，增加噬菌体的效价。

制备噬菌体浸出液：用已灭菌的镊子挑取单个噬菌斑于500 μl的生理盐水中，40℃水浴30 min后4000 rpm离心10 min，过滤之后得噬菌体的浸出液。

选用LB肉汤液体培养基对噬菌体进行增殖，操作过程如下：各取200 μl的单一菌悬液和200 μl的噬菌体浸出液加入到盛有5 ml的LB肉汤液体培养基中，分别相应编号，空气浴振荡器37℃ 160 rpm振荡培养3～4 h，期间每隔半个小时观察1次，可见菌悬液和噬菌体浸出液的混合液由浑浊变清亮的整个过程。待混合液变澄清后装入到10 ml的无菌离心管中，4000 rpm离心10 min。

取出上清液与等量的菌悬液混合均匀加入60%LB甘油4℃保存以备用[7～9]。

1.2.6 噬菌体裂解谱的测定

本试验采用双层平板法对噬菌体进行24株致病性大肠杆菌裂解谱的测定。所用方法如下：分别挑取24株大肠杆菌的单菌落接种于盛有5 ml的LB肉汤液体培养基中，37℃ 160 rpm振荡培养10 h，得各株大肠杆菌的菌悬液。

为保证结果准确性，需对噬菌体滤液进行倍比稀释。方法如下：分别取90 μl的生理盐水于3只无菌的EP管，标号1、2、3。取10 μl的噬菌体滤液于标号为1的EP管中，用微量移液器充分混合均匀后取10 μl的混合液于标号为2的EP管中，重复上述步骤。

各取20 μl菌悬液和20 μl噬菌体混合液37℃温箱中孵育15 min后，加入到已融化好的上层琼脂培养基中（55℃）中，手搓试管，使混合悬液与上层培养基混匀，混匀后迅速对号倒入已准备好的底层琼脂培养基上，轻摇平皿使上层培养基铺满平板，凝固后37℃倒置培养3～6 h，观察结果。

2 结果与分析

2.1 分离噬菌体及测定裂解谱

通过利用双层平板法从垫料中分离到两株噬菌体：BP13、BP14，噬菌斑的形态、大小见图1。

图1 噬菌斑的形态

由图1可以看出，噬菌体BP13，BP14均可以形成边缘整齐透明的噬菌斑。BP13、BP14噬菌体经过培养4～6 h后可得到直径约1 mm的噬菌斑。

2.2 噬菌体裂解谱

采用双层平板法对噬菌体进行裂解谱的测定，采用LB肉汤液体培养基的方法噬菌体BP13、BP14的裂解谱进行鉴定（见表1）。

表1 2株噬菌体裂解谱的测定结果

采用双层平板法，以24株致病性大肠杆菌为宿主菌，噬菌体BP13对致病性大肠杆菌的裂解谱最为广泛，能完全裂解3号、7号、8号、9号、10号、21号、23号、24号、25号、34号、39号、44号，能使27号大肠杆菌的双层平板上有噬菌斑，不能使其LB肉汤液体培养基变澄清，宽噬率为50%。BP14能完全裂解21号，22号，宽噬率为8.33%，能使11号、18号、29号、34号大肠杆菌的LB肉汤液体培养基变澄清，不能使其双层平板上出现噬菌斑。噬菌体BP14及BP13裂解大肠杆菌的时间有差异（见表2）。

表2 2株噬菌体澄清所需时间

由表2可知，采用LB肉汤液体培养基可观察到2株噬菌体的增殖速度不同，噬菌体BP13比BP14裂解速度快。同一噬菌体对不同的致病性大肠杆菌的裂解时间也不同。BP13能够使34号、39号致病性大肠杆菌快速裂解，裂解速度最快。BP14能够使21号致病性大肠杆菌快速裂解，裂解速度最快。

3 讨论

3.1 关于噬菌体的分离

通过对噬菌体进行多次的分离后，在双层琼脂平板上得到了透明规则，直径约为1 mm的噬菌斑。分离噬菌体时需要注意事项如下：

（1）采集垫料：需要注意不能只取单只鸡的或只取自一堆，应取相隔较远不同排或是不同鸡舍的垫料，因为单只鸡体内含有噬菌体的可能性非常小，同时这样也避免了只是取到同一种噬菌体的可能性，大堆垫料中环境复杂细菌的种类多因此含有不同种噬菌体的概率也比较大[10～11]。（2）垫料处理：初步处理时最好把垫料放入无菌容器内，并加入生理盐水搅成糊状后，用筛粪器或纱布将垫料中的大颗粒去除，防止初次取增殖液的时堵塞移液枪。同时使垫料中的噬菌体分布均匀，避免加样的时候所加入的垫料中不含有噬菌体。（3）将垫料2 g加入到混合菌悬液中振荡摇匀，轻轻吸取上层液体，离心后要轻拿轻放。离心后的液体注意一定要注意过滤，防止分离噬菌体时双层平板上可能出现杂菌，影响试验结果。（4）初次分离得到的噬菌斑可能形状各异，大小不一。当出现疑似噬菌斑时，需要经过验证加以确定。用无菌生理盐水浸润可疑噬菌斑30～45 min，使噬菌体游离出来，离心之后再做双层平板。当在双层平板上再次出现相似噬菌斑时，才能证实从垫料中分离到了相应的噬菌体。当分离到相应噬菌体后，选取大小适合的噬菌斑进行纯化，才能得到理想效果的噬菌斑。

3.2 关于噬菌体裂解谱的测定

双层平板法从垫料中分离得到2个噬菌斑，经过裂解谱的测定发现这是两株不同的噬菌体。再进一步用LB肉汤培养基检验发现这两种噬菌体的生长时间，以及裂解大肠杆菌的程度都不相同，可以确定这是两种不同的噬菌体。

由于本试验的目的是筛选出宽噬噬菌体，还需要对分离到的噬菌体进行纯化和增殖。经过鉴定发现，BP13号噬菌体可以完全裂解3号、7号、8号、9号、10号、21号、23号、24号、25号、34号、39号、44号致病性大肠杆菌，裂解率达50%。BP14号噬菌体可以完全裂解21号、22号致病性大肠杆菌，裂解率达8.33%。

4 小结

从垫料中分离出两株不同噬菌体，并利用双层平板法和24株致病性大肠杆菌对分离到的噬菌体进行裂解谱的测定。BP13可裂解12株致病性大肠杆菌型细菌，宽噬率为50.0%；BP14可裂解2株致病性大肠杆菌型细菌，宽噬率为8.33%。