肺炎支原体感染诊断方法的研究进展

孙国磊，王一民

(1.天津市津南医院急诊科，天津300052； 2.中日友好医院呼吸中心呼吸与危重症医学科二部，北京100029)

肺炎支原体是社区获得性肺炎的常见病原体，我国肺炎支原体肺炎发病率较高，全国性多中心社区获得性肺炎流行病学调查显示，肺炎支原体肺炎占20%～30%，且儿童及青年人群的发病率可能更高[1-2]。肺炎支原体肺炎缺乏特异性临床表现、影像学表现复杂多样，早期快速诊断困难，导致肺炎支原体肺炎初始治疗失败风险及后续治疗难度的增加。因此，了解肺炎支原体检测的进展对提高肺炎支原体肺炎的诊治水平十分重要。

肺炎支原体是一种非典型病原体，无细胞壁，大小(0.1～0.3 nm)介于细菌及病毒之间，多可独立存活，经呼吸道飞沫传播。肺炎支原体感染引起的感染性疾病可发生于任何年龄人群，儿童感染率高于成人，且患病率逐年增加。有研究报道，约50%的肺炎支原体感染患者的临床表现明显，大多数成人感染者仅出现上呼吸道感染症状[3]。但随着疾病进展，肺炎支原体感染不仅引起成人肺部严重疾病，还常导致心血管系统和神经系统等肺外并发症。近年来，难治性肺炎以及耐药性肺炎支原体感染病例逐年增加，每隔3～7年肺炎支原体感染会发生一次地方性流行或大流行，严重威胁居民身体健康[4]。肺炎支原体感染缺乏特异性临床表现和影像学表现，且缺少微生物确诊检测方法，临床诊断困难，易错过最佳治疗时机，因此提高肺炎支原体检测的准确性对减轻患者疾病负担尤为重要。

病原体培养是目前公认的肺炎支原体诊断“金标准”，但存在检测方法局限、灵敏度低等缺点，其对临床诊断和治疗的帮助有限。现就肺炎支原体感染诊断方法的研究进展予以综述，以期提高肺炎支原体感染的诊疗水平。

1 临床表现

人群对肺炎支原体普遍易感，尤其是儿童。由于小儿呼吸系统和心血管系统尚未发育成熟，故临床表现复杂多样，且易出现肺内外并发症。肺炎支原体的常见临床表现为干咳、胸闷气促、发热、头痛、肌痛和胃肠道症状。大多数单纯肺炎支原体感染者无明显肺部体征，若感染波及其他系统可引发脑梗死、脑炎、脑膜炎、心动过缓、急性肾小球肾炎、多形性红斑或溶血性贫血等疾病[5-6]。此外，肺炎支原体感染者体温变化较大，可出现低热或超高热，发热前常出现畏寒症状。总之，肺炎支原体感染者缺乏特异临床表现，多数患者发病初期可表现类似于普通上呼吸道感染的症状，故单纯依据临床症状诊断较困难，需借助其他辅助检查加以鉴别。

2 影像学表现

近年来，影像学检查在肺部感染诊治中发挥着不可忽视的作用，以X线和CT检查最常见，CT检查的分辨率和定性诊断准确率均高于X线，在肺部感染早期诊断中具有重要意义[7]。赵志勇等[8]比较细菌性、病毒性和支原体肺炎患者的CT影像学资料发现，肺炎支原体肺炎主要以双下肺居多(62.0%)；肺炎支原体肺炎与病毒性肺炎均存在间质增厚、磨玻璃影等征象，但支气管壁增厚是肺炎支原体肺炎区别于细菌性肺炎、病毒性肺炎的典型影像学。肺炎支原体肺炎的影像学表现复杂多样，除上述特点外，还可见小叶中心结节(伴或不伴树芽征)，肺泡腔内渗出改变等，上述表现可先后出现或同时出现。另有研究显示，重症肺炎支原体肺炎病例CT影像常表现为叶段实变，类似于细菌性肺炎[9]。日本一项回顾性研究显示，39%的重症暴发性肺炎支原体肺炎患者肺部存在叶段实变，其中25%以叶段实变为唯一影像学表现[10]。此外，影像学检查可及时观察肺内病灶范围及形态变化。因此，可通过CT联合流行病学、临床表现、实验室检查等，对肺炎支原体感染进行早期诊断和治疗。

3 病原学检测

3.1肺炎支原体分离培养 肺炎支原体繁殖速度缓慢，1～6 h分裂一代。肺炎支原体分离培养以鼻咽拭子、痰标本、口咽分泌物、肺泡灌洗液和胸腔积液等作为培养标本，以SP4作为培养基，一般在37 ℃、湿度60%～80%环境下，在琼脂内加入5%的CO2进行培养[11]，这是肺炎支原体应用最广泛、最成功的培养手段。不同标本的培养阳性率不同，培养过程中需每天观察培养基菌落的颜色和形态改变。刘金荣等[12]对比分析咽拭子和支气管肺泡灌洗液标本肺炎支原体培养的差异发现，两者荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测的阳性率均为86.2%(25/29)，结果一致率为93.1%(27/29)；其中，肺泡灌洗液培养阳性率为65.5%(19/29)，标本污染率为6.9%(2/29)，咽拭子标本阳性率为51.7%(15/29)，污染率51.7%(15/29)；故认为咽拭子可作为荧光PCR定性检测标本，但不适合用于病原体定量研究，而肺泡灌洗液更适合用于肺炎支原体分离培养研究。因此，可根据患者耐受程度、标本获取难度、临床表现等具体情况选择标本种类，并在留取标本后及时保存运输，以免影响检测准确性。随着耐药性及难治性肺炎支原体感染的增多，分离培养法的应用率明显升高，但尚缺乏统一的肺炎支原体分离培养测定标准。分离培养法可有效确定肺炎支原体的致病性及药物敏感性，被称为诊断肺炎支原体的金标准之一，但存在培养长、培养基昂贵、培养阳性率较低等缺点，临床应用受限。分离培养与鉴定技术相对复杂，临床难以开展，且无法满足临床极危重症病例的需要。

3.2抗原检测 肺炎支原体抗原检测方法包括直接免疫荧光法、蛋白印迹法、对流免疫电泳等，但灵敏度低，易与呼吸道其他病原出现交叉反应，诊断准确率较低，临床应用受阻，故通常该检测结果不作为诊断依据[13]。

3.3抗体检测 人体感染肺炎支原体后产生特异性抗体，包括免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)M、IgG和IgA，临床常采用IgM和IgG抗体进行检测。血清IgM抗体出现较早，临床症状出现1周后可被检出，10～30 d达高峰，12～26周消失；IgG在IgM之后产生，1个月左右达高峰，持续时间长。抗体检测方法有冷凝集试验(cold agglutination test，CAT)、免疫荧光试验(immunofluorescence assay，IFA)、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和补体结合试验等。

冷凝集是机体对肺炎支原体感染产生的非特异性反应，其冷凝集素为IgM抗体，可在0～5 ℃内凝集红细胞，但CAT不能直接用于肺炎支原体检测。研究表明，约75%的患者在肺炎支原体感染后7～10 d冷凝集素滴度≥1∶32，并常于6～8周后逐渐恢复正常，因此冷凝集素滴度越高，提示肺炎支原体感染的可能性越大[14]。由于支原体感染抗体与巨细胞病毒感染、自身免疫性疾病等存在交叉，故CAT的特异性较低。李观颖[15]比较CAT和ELISA早期检测肺炎支原体的价值显示，CAT检测的阳性率明显低于ELISA，但两种方法的检测阳性率均随发热时间的延长而增高。

IFA基于抗原-抗体反应，包括直接IFA和间接IFA，目前间接IFA较常用。于艳红等[16]通过间接IFA、被动凝集法、化学发光法对沈阳儿童医院162例呼吸道感染患儿进行肺炎支原体IgM检测发现，间接IFA和被动凝集法的检测灵敏度、特异度、准确度高于化学发光法，且间接IFA的检测特异度高于被动凝集法、化学发光法。梅方超等[17]的研究提示，培养法检测肺炎支原体感染的特异度高，但灵敏度较低，对操作者技术要求较高，同时IFA检测灵敏度和特异度均较高，可作为早期筛查的方法。

颗粒凝集法是使用肺炎支原体体细胞膜成分致敏乳胶或明胶颗粒，在室温下共同培养待检血清和致敏颗粒，若血清内存在特异性抗体，易发生颗粒凝集，肉眼可见抗体反应，主要是共同检测抗体IgG及IgM。该方法操作方便、快捷，但不同抗体滴度条件下的诊断灵敏度及特异度存在差异，抗体滴度≥1:160时，诊断效力最强。严华杰等[18]发现，被动颗粒凝集法检测肺炎支原体IgM的阳性率高于间接IFA。李胜兵[19]报道，被动颗粒凝集法、间接IFA检测肺炎支原体的阳性率分别为33.06(81/245)和28.98%(71/245)，两种方法检测一致性Kappa值为0.733，具有中等程度的诊断一致性，故两者联合检测可为肺炎支原体感染提供全面诊断依据。因此，颗粒凝集法可用于肺炎支原体感染诊断，但其与间接IFA联合应用仍需进一步探讨。

ELISA是将酶标记抗人IgM及IgG单克隆抗体，可分别检测血清抗体IgM、IgG，并进行定量分析，可与PCR技术相比拟，不需要特殊设备，但个别患者需采集双份血清。黄象维等[20]研究显示，ELISA检测肺炎支原体的阳性率高于CAT，且发热1～3 d、4～7 d、8～14 d、≥15 d采用ELISA检测肺炎支原体的阳性率均明显高于CAT。岳晓红等[21]报道称，实时荧光核酸恒温扩增检测技术、胶体金法及ELISA可用于发病初期肺炎支原体检测，胶体金法和ELISA可用于疾病痊愈期肺炎支原体的检测。由此可见，ELISA可用于疾病早期及疾病痊愈期的肺炎支原体检测。另外，补体结合试验主要检测抗体IgM，但容易与生殖道支原体、人体组织等产生交叉反应，且操作繁杂，不适宜在临床应用。

在肺炎支原体感染急性期和恢复期，肺炎支原体抗体滴度升高4倍以上，是临床诊断的金标准，发病1周左右IgM阳性率约为80%，且血清IgM抗体滴度随症状的持续而增高，其诊断灵敏度随之增高[22]，IgM阳性提示近期感染；因此，IFA和(或)颗粒凝集法、ELISA可用于肺炎支原体感染的早期诊断。IgG抗体阳性并不提示肺炎支原体的现症感染，可用于回顾性诊断及流行病学调查。目前我国肺炎支原体抗体试剂盒的灵敏度及特异度参差不齐，有学者曾经用逆转录PCR的检测结果对临床普遍使用的12种商用肺炎支原体IgM试剂盒进行评价，结果发现，在肺炎支原体肺炎发病6 d内，多数肺炎支原体IgM试剂盒的阳性率低于10%，阳性率最高者低于30%[23]。可见，绝大多数医院仅通过血清学抗体检测不能实现肺炎支原体肺炎的及时确诊。

3.4分子诊断技术 分子诊断技术自20世纪60年代出现以来，大致经历了基于分子杂交的分子技术、核酸测序技术、基于分子构象的分子诊断技术、定量PCR技术等阶段。目前，分子诊断技术检测的灵敏度、准确度、特异度得到了快速提升。

3.4.1核酸杂交 通过检测使用生物素、酶等标记的探针和核酸片段得到的特异杂交信号确定病原体是最先出现的核酸杂交技术。探针是核酸杂交的关键，1987年Hyman[24]用载体构建支原体基因文库，并从中筛选制备出特异性DNA探针，通过斑点杂交，可检测仅含0.1 ng的特异性支原体DNA，其检测的特异度和灵敏度接近100%，尤其是随后的荧光原位杂交，在分子诊断技术早期发挥了关键性作用，但该技术主要应用于生殖道支原体(如人型支原体)感染的诊断。

3.4.2实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR技术的出现弥补了临床肺炎支原体等非典型病原体病原分离培养困难的缺陷。Morozumi等[25]采用实时定量PCR检测429例成人和儿童肺炎临床标本中的肺炎支原体16S核糖体RNA，整个检测过程仅耗时2 h，且较传统细菌培养方法的灵敏度和特异度大大提高，PCR技术检测快、灵敏度和特异度高，可用于肺炎支原体感染的早期诊断。刘君丽[26]研究显示，实时荧光定量PCR检测可作为诊断前期肺炎支原体感染的可靠、有效方法。冯志山等[27]报道，荧光定量PCR与多重PCR检测肺炎支原体的一致性高于被动凝集法，且荧光定量PCR的肺炎支原体阳性检出率与患者病程相关。此外，肺炎支原体感染易合并病毒和细菌混合感染，难以区分携带者或感染者，因此PCR阳性结果仍需进一步分析才能确诊。

在病原耐药性检测中，PCR也起到了重要作用。近年来，全球范围内肺炎支原体大环内酯类药物的耐药率呈上升趋势，调查显示，北美地区肺炎支原体对大环内酯类药物的耐药率已经超过10%，东亚地区是全球肺炎支原体大环内酯类药物耐药情况最严重的地区，其中日本和中国肺炎支原体对大环内酯类药物的耐药率均已接近90%，我国肺炎支原体对大环内酯类药物的耐药水平普遍为高水平耐药[28]。大环内酯类药物治疗失败不仅导致支原体肺炎退热时间和抗感染疗程延长，少数患者也因未得到及时有效治疗而进展为重症肺炎，甚至危及生命[29]。研究发现，1/3经大环内酯类抗生素治疗支原体感染者23S核糖体RNA基因出现了点突变[30]，其核糖体蛋白质L4和L22没有变化，核糖体RNA基因选择性突变，造成了对大环内酯类抗生素的耐药。Stakenborg等[31]的研究发现，肺炎支原体对应的16元环大环内酯类抗生素敏感菌株的最低抑菌浓度只有0.03～0.125 μg/mL，耐药菌株的最低抑菌浓度为8～16 μg/mL；对应的15元环大环内酯类抗生素敏感菌株仅0.06～0.5 μg/mL，耐药菌株的最低抑菌浓度>64 μg/mL。应用PCR技术进行耐药检测，减少了培养、药敏试验等复杂的检验步骤。

3.5其他指标 为进一步提高肺炎支原体感染的诊断准确性，吴素丽等[32]对328例疑似肺炎支原体感染患者进行分析，根据DNA结果分为肺炎支原体阳性组和肺炎支原体阴性组，并选取健康儿童作为对照发现，肺炎支原体感染患者外周血白细胞、C反应蛋白、D-二聚体水平升高，各指标对肺炎支原体感染具有一定的诊断价值，联合运用有助于肺炎支原体的临床筛查及早期诊断。张玲玲等[33]利用ELISA检测对比肺炎支原体肺炎、非肺炎支原体肺炎患儿和健康儿童的血清标志物发现，血清七肽TVNFKLY和LPQRLRT可作为诊断儿童肺炎支原体肺炎的潜在标志物，两者联合诊断儿童肺炎支原体肺炎的灵敏度为92.5%(111/120)，特异度为90.83%(218/240)，准确度为91.39%(329/360)。另有研究发现，重症暴发性支原体肺炎患儿血清C反应蛋白、白细胞介素-6、白细胞介素-8及肿瘤坏死因子-α表达水平均显著升高，提示上述细胞因子参与了重症肺炎的发生、发展[34]，但缺乏诊断特异性。

4 小 结

近年来，肺炎支原体感染的患病率处于较高水平，缺乏特异性临床特征，无法快速诊断且存在病原菌耐药给肺炎支原体肺炎的临床治疗带来很大困难，严重威胁患者健康，甚至威胁重症患者生命安全。深入研究肺炎支原体检测方法和诊断标志物对肺炎支原体肺炎的及时诊断具有重要的临床意义。与分离培养、血清抗原抗体检测相比，分子诊断技术具有检测快、灵敏度高、特异性强等优点，可用于肺炎支原体感染的早期诊断，也可用于耐药性检测以及肺炎支原体感染者与携带者的鉴别。