cGAS-cGAMP-STING 通路在抗病毒中的作用

张 倩，章越凡，李铁军 （1. 安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 20012；2. 上海市浦东新区浦南医院，上海 200125；. 上海大学医学院，上海 200444）

先天性免疫是机体防御病毒感染的第一道防线也是获得性免疫触发的先决条件。当病毒进入机体细胞，胞质内的感受器即被活化，而胞质感受器启动的信号最终激活STING 受体，诱导产生Ⅰ型IFN 和促炎性因子。2012 年首次报道STING上游通路的关键分子是cGAMP，可由胞质内的cGAS 催化生成，cGAMP 作为人体内的第二信使，在天然免疫信号通路中发挥着重要作用。cGAMP可与接头蛋白STING 结合并活化STING，进一步激活TANK 结合激酶1(TBK1），诱导转录因子干扰素调节因子3(IRF3）和NF-κB 入核，产生Ⅰ型IFN和细胞因子，以便机体清除入侵的病原微生物，从而防御各种病毒感染[1]，维持机体健康稳态。cGAScGAMP-STING 通路在抗病毒药物研发中的作用引起越来越多科学家的关注，本文就该通路的最新研究进展及其在抗病毒中的作用进行系统的梳理概括。

1 cGAS-cGAMP-STING 通路及其发现历史

STING 是一种完整的内质网（ER）膜蛋白，可通过结合cGAS 合成的2'3'-cGAMP 形成二聚体，招募TBK1，磷酸化IRF3，从而使一系列的信号传递下去，最后诱导干扰素的产生。研究者早期认为cGAMP 只存在于细菌等低等生物细胞中，直到2013 年发现哺乳动物细胞中也含有cGAMP[2]。cGAMP 作为第二信使，可以直接结合STING 并活化STING 及其上游关键合成酶cGAS。2012 年陈志坚团队[3]检测到cGAS 能感知到胞质DNA 的存在，并激活一系列炎症反应。胞质DNA 与cGAS结合，诱发cGAS 的催化中心发生构象改变，把GTP和ATP 转化为cGAMP。 Swanson 等[4]发现cGAMP除了激活Ⅰ型IFN 外，还激活了炎性小体，抑制DNA病毒的感染。

有研究显示，真核细胞中的cGAS-cGAMPSTING 信号通路的抗病毒作用有着古老的进化起源，其进化于微生物对噬菌体的防御机制[5]。越来越多的研究发现该通路在癌症、抗病毒、抗炎症反应和疫苗研发等领域都是一个十分具有前景的医疗靶点[6-9]。

2 cGAS-cGAMP-STING 信号通路在抗病毒中的作用

2.1 对DNA 病毒的作用

cGAS-cGAMP-STING 信号通路是被内源性和外源性的DNA 所激活，因此，该通路主要针对DNA病毒起作用。DNA 病毒主要包含疱疹病毒（HSV）、腺病毒（ADV）、伪狂犬病毒（PRV）、痘病毒（Poxvirus）和乙肝病毒（HBV）。cGAS-cGAMP-STING 通路对DNA 病毒的影响作用取决于DNA 病毒种类，另外，相比于抑制病毒的复制，cGAS-STING 通路更倾向通过抑制旁观者细胞（bystander cell）的传播来发挥抗病毒作用[10]，如卡波济肉瘤病毒（KSHV）。在人细胞模型、小鼠细胞模型和小鼠动物模型中，HSV-1 感染后， STING 促使NLRP3（ NOD-like receptor protein 3）定位于内质网，并促进NLRP3 的脱泛素化从而激活炎性小体，使得cGAS-cGAMPSTING-NLRP3 在抗HSV-1 感染中起到了重要作用[11-12]。β-连环蛋白可以促进cGAS-cGAMPSTING 通路中Ⅰ型IFN 的产生，从而更好地发挥抗HSV-1 的作用。HSV-1 的US3 是HSV-1 壳外蛋白，可作为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，HSV-1 可通过US3 高度磷酸化β-连环蛋白以抵消β-连环蛋白的抗HSV-1 作用[13]。Li 等[14]通过IP 和nano-LCESI-MS / MS 分析进行的公正筛选已确定三结构域蛋白家族21（TRIM21）是泛素E3 连接酶，能促进γ-干扰素诱导蛋白16（IFI16）进出，引起IFI16 蛋白进入泛素-蛋白酶体途径降解，IFI16-K3 / 4 /6R 突变可延长IFI16 的半衰期，诱导更多STING依赖性I 型IFN 和下游干扰素刺激基因（ISGs）表达，从而使细胞对HSV-1 病毒感染更具有抵抗力。Zhou 等[15]的研究发现阴离子通道LRRC8/VRAC是一个跨细胞膜转运cGAMP 的转运蛋白，能将HSV-1 感染细胞产生的cGAMP 转运到非感染细胞中，激活STING 信号和干扰素应答，从而发挥抗HSV-1 作用。

另外，cGAS-cGAMP-STING 通路在抗人类巨细胞病毒 (HCMV)中发挥着重要作用[16]。STING高表达可以显著降低HCMV 在人成纤维细胞中的复制[17]。

Wang 等[18]研究发现猪干扰素诱导的跨膜蛋白1（pIFITM1）是宿主抑制PRV 感染的限制性因素，而PRV 诱导的pIFITM1 的表达依赖于cGAScGAMP-STING 先天性免疫信号通路和Ⅰ型IFN受体。Cheng 等[19]研究表明，cGAS-cGAMP-STING途径对于感知鼠痘病毒（ECTV）感染，诱导Ⅰ型IFN 产生以及控制ECTV 复制至关重要。ECTV是一种研究宿主与正痘病毒关系的有价值模型。实验表明，缺乏cGAS 或STING 的小鼠表现出较低的Ⅰ型IFN 水平和较高的病毒载量，并且对鼠痘更敏感。但是，其对ECTV 反应的作用目前尚不清楚。

Ito 等[20]设计了STING 通路的配体cGAMP作为HBV 疫苗佐剂功效的动物实验，使野生型（WT）和HBV 转基因（HBV-Tg）小鼠均接种乙型肝炎表面抗原（HBsAg）和cGAMP，结果发现HBsAg和cGAMP 的疫苗接种显著增强了WT 和HBVTg 小鼠对HBsAg 的体液免疫和细胞免疫反应。cGAMP 诱导了与辅助性T 细胞1（Th1）和Th2 响应相关的细胞因子的释放，并诱导激活了淋巴组织中的抗原呈递细胞。基于以上实验，Ito 等认为cGAMP 进行疫苗接种可以克服慢性HBV 感染患者的耐受性。

Pepin 等[21]证明cGAMP 依赖连接蛋白转移至吞噬细胞可以调节抗DNA 病毒效应，使上皮细胞和巨噬细胞共培养，上皮细胞中的cGAMP 可以直接转移至巨噬细胞胞内，从而反式激活巨噬细胞中STING 信号通路。cGAMP 的转移依赖于上皮细胞中连接蛋白的表达，抑制连接蛋白的表达会使该途径的STING 通路的激活减弱。cGAMP 反式激活巨噬细胞又起到了正反馈的作用，放大了STING 通路的抗病毒作用。Wang 等[22]发现通过增加DNA 传感器cGAS 及其下游衔接蛋白STING的敏感性来对抗DNA 病毒，此反应中Mn2+是必需的。Mn2+增强了cGAS 对dsDNA 的敏感性及其酶促活性，Mn2+还通过增加cGAMP-STING 结合亲和力来增强STING 活性。这些发现表明，Mn2+是宿主抵御DNA 病毒的关键物质。

2.2 对RNA 病毒的作用

虽然登革热病毒（DENV）是一种生命周期中没有DNA 阶段的RNA 病毒，它也可以通过STING的蛋白水解作用来操纵cGAS-STING 介导的先天性免疫。Su 等[23]进行的共培养细胞模型发现，随着人STING 单倍型的不同，STING 对DENV 蛋白酶的敏感性也不同，在DENV 感染后控制细胞因子的产生和病毒复制的效果也不同。外源重新激活的病毒DNA 进一步增强了DENV 蛋白酶与STING 相互作用和裂解的能力。DENV 感染会降低具有蛋白酶敏感性STING 单倍型细胞的宿主先天性免疫。然而，研究者在鼠类和非人灵长类动物中也发现了对登革热蛋白酶耐受的STING，揭示STING 可能是不同物种限制登革热病毒复制的一种宿主因子。

Gutjahr 等[24]通过在鼻内单独给HIV-1 Gag p24纳米颗粒（NP-p24）或与2'3'-cGAMP 合用一起接种于CB6F1 小鼠，发现相对于单独接种NP-p24 的小鼠，用NP-p24 加2'3'-cGAMP 接种的小鼠的病毒复制得到了更为有效的控制，且小鼠的黏膜和全身性HIV-1 Gag p24 特异性IgA 和IgG 滴度非常高，但是，在单独接种NP-p24 的小鼠中并未检测到。cGAMP 并行引发体液免疫反应的能力，包括在黏膜表面分泌IgA，可能对某些病毒感染（如HIV-1）有作用。

3 cGAS-cGAMP-STING 信号通路调节剂在抗病毒中的作用

3.1 正反馈调节剂在抗病毒中的作用

Hou 团队[25]基于细胞分析，从合成的小分子中鉴定出具有吖啶酮骨架的化合物2g、9g 和12b 是STING 激动剂，它们在整个物种中均是STING 的激动剂。其中，12b 活性最好，并且其对人和鼠STING 依赖性信号的诱导均与2'，3'-cGAMP 相似。蛋白质分析表明2g、9g 和12b 可以通过直接与STING 结合从而激活STING 通路，而12b 与STING 的亲和力更强。而且与2'，3'-cGAMP 相比，12b 可以诱导各种细胞因子产生更快，更强劲和更持久的免疫应答。基于此，团队首次成功修饰鼠STING 激动剂以获得人类敏感性，这些结果表明，12b 是有效的人STING 激动剂。此外，吖啶酮类似物显示出巨大的抗病毒或抗肿瘤治疗潜力。Zhang 等[26]报道了基于细胞的高通量筛选测定法，该测定法可用于鉴定小分子cGAS-cGAMP -STING途径激动剂，发现6-溴-N-（萘-1-基）苯并[d][1,3]二唑-5-羧酰胺（BNBC）是cGAS-cGAMP -STING途径的激动剂，不仅可以诱导针对多种病毒的先天抗病毒免疫力，而且还可以刺激适应性免疫应答的激活。Lian 等[27]的研究发现CCHC 型锌指蛋白3（ZCCHC3）缺乏抑制dsDNA 和DNA 病毒触发的下游效应基因的诱导，ZCCHC3 直接与dsDNA 结合，增强cGAS 与dsDNA 的结合，这对病毒感染后cGAS 的激活很重要。Ku 等[28]发现了类鼻疽杆菌T6SS5 依赖性细胞融合触发宿主中的Ⅰ型IFN基因表达，并导致cGAS-STING 通路激活，cGAS和STING 的激活导致自噬细胞死亡。他们提出：cGAS-STING 途径通过微核形成将异常的细胞融合感知为危险信号，并因此通过自噬死亡的诱导限制异常的被病毒感染的细胞分裂和限制潜在的细胞转化。Palermo 等[29]的研究发现，STING 激动剂cGAMP 与FDA 批准的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂（resminostat）的组合可显著增加HIV 感染前细胞的HIV 前病毒激活率和特异性凋亡，降低HIV感染细胞的比例并在CD4（+）中央记忆T（TCM）细胞中观察到了HIV DNA 的总量，该研究通过减少病毒库并诱导HIV 感染细胞的特异性死亡，代表了一种消除HIV 的新策略。

3.2 负反馈调节剂在抗病毒中的作用

Kawasaki 等[30]发现STING 转运受到肌管蛋白相关蛋白（MTMR）3 和MTMR4 的调节，而MTMR3 和MTMR4 可以调节PtdIns3P（磷脂酰肌醇）的产生，PtdIns3P 可通过调节STING 转运来抑制DNA 介导的先天免疫应答，并发挥关键作用。Ghosh 等[31]研究发现I 型干扰素诱导型人寡腺苷酸合成酶样蛋白（OASL）是cGAS-cGAMP-STING途径的负反馈调节剂，OASL 独立于双链DNA，直接且特异性地与cGAS 结合，从而与第二信使cGAMP 产生非竞争性抑制，起到负反馈调节cGAScGAMP-STING 通路的作用。Jia 等[32]的研究发现，病毒感染导致胞内脂质过氧化水平升高，产生4-羟基壬烯酸（4-HNE）等脂质过氧化代谢产物，促进STING 羰基化、抑制STING 活化。谷胱甘肽过氧化物酶（GPX4）通过将高反应性脂质过氧化物(L-OOH)转化为低反应性脂质醇(L-OH)，保护细胞免受脂质过氧化作用并维持胞浆内氧化还原平衡。而GPX4 缺陷通过增强脂质过氧化可进一步促进4-HNE 产生、特异性抑制cGAS-STING 介导的DNA 识别通路，从而抑制抗DNA 病毒免疫反应。Huang 等[33]确定HCMV 蛋白UL31 作为cGAS的抑制剂。UL31 直接与cGAS 相互作用，并使DNA 与cGAS 分离，从而抑制cGAS 的酶功能并降低cGAMP 的产生。UL31 的过表达有效抑制抗病毒应答，而敲低或敲除UL31 则明显增强了HCMV 诱导Ⅰ型IFN 和下游抗病毒基因的生成。Fu 等[34]的研究结果表明HCMV UL42 也是cGAS依赖性抗病毒反应的抑制剂。

4 总结与展望

近几年，人们在理解胞质DNA 传感和信号转导方面取得显著进步，尤其是在cGAS 和cGAMP鉴定方面取得重大突破。大量证据清楚地表明cGAS-cGAMP-STING 途径在抗病毒中的作用，这归因于胞浆DNA 的识别和Ⅰ型IFN 的产生。cGAMP可有效抗病毒复制，延长病毒滞留时间，延长生存周期，因此，可用于制备治疗HBV、HCV 等病毒的药物。cGAS 激活典型的模式识别受体（PRRs）通路，通过STING 上调IFNs 的表达，进而诱发抗病毒的活性。最近报道，该通路的激动剂具有良好的抗病毒作用，有望进一步开发为抗病毒新药。

尽管cGAS-cGAMP-STNG 通路被发现和研究多年，但是STNG 信号相关的网络结构并不完善，其与其他通路如caspase 1/9、STAT、NF-κB 等的交互作用并不是完全清楚，接下来的工作需要完善该信号网络，为基于靶点的药物设计提供药理机制基础。