基于Wnt/β-catenin信号通路的中药单体治疗结直肠癌的作用机制研究进展

徐晓华，吴煜

(中国中医科学院西苑医院肿瘤科，北京 100091)

结直肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤。国际癌症研究机构的GLOBOCAN数据显示，2020年预计全球肿瘤新发病例约1 930万例，死亡病例约1 000万例，其中结直肠癌占所有新发病例的10.0%，仅次于乳腺癌和肺癌，占所有死亡病例的9.4%，仅次于肺癌[1]。据国家癌症中心数据显示，2015年我国结直肠癌新发病例38.8万例，死亡病例18.7万例，其发病率和死亡率分别居恶性肿瘤的第3位和第5位[2]。目前，对于结直肠癌的治疗，除了手术、化疗、放疗、靶向治疗、免疫治疗外，中医药治疗也是重要的治疗方式之一，其临床应用广泛，既对癌前病变和复发转移具有一定的预防作用，又能协同化疗，提高化疗完成率，减轻化疗不良反应，同时在肿瘤患者身体、心理、功能等方面的康复治疗中也发挥核心作用[3]，但中药化学成分复杂，作用机制多样，缺乏一定的精准性。

与传统中草药相比，中药单体化学成分单一，用药剂量小，作用机制明确，在基础研究和新药研发中具有一定优势。随着医学研究的深入，越来越多的中药单体被发现对结直肠癌具有明确的作用，如白藜芦醇[4]、粉防己碱[5]、姜黄素[6]等。Wnt/β联蛋白(β-catenin)信号通路是肿瘤经典的信号通路，Wnt家族通过转录辅激活因子β-catenin的信号通路调控胚胎发育和成人稳态，并与先天畸形、癌症、骨质疏松等疾病相关[7]。根据是否存在β-catenin依赖性，Wnt信号通路可分为经典和非经典信号通路[8]，在已知的Wnt信号级联反应中，约90%的结直肠癌Wnt/β-catenin信号通路(经典Wnt信号通路)发生突变[9]。现就基于Wnt/β-catenin信号通路的中药单体治疗结直肠癌的作用机制研究进展予以综述，以期为中药单体在结直肠癌的研究和应用提供参考。

1 Wnt/β-catenin信号通路

Wnt蛋白是富含半胱氨酸的分泌糖蛋白，分子量约为40 000，可以调节Wnt/β-catenin信号通路核心介质β-catenin的转录活性，是稳定β-catenin的关键细胞外调节因子[10]。正常情况下，轴抑制蛋白(axis inhibition protein，AXIN)、结肠腺瘤性息肉病(adenomatous polyposis coli，APC)蛋白、酪蛋白激酶1α和糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)形成的破坏复合物(AXIN复合物)可以介导β-catenin磷酸化，进而被蛋白酶体26S降解，而Wnt糖蛋白配体与Fzd(Frizzled)受体和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6)形成的Wnt-Fzd-LRP5/6复合物可以将蓬乱蛋白转移到质膜，募集破坏复合物与受体结合进而介导LRP5/6磷酸化，该过程抑制了β-catenin磷酸化，导致β-catenin发生胞质积累和核转运，β-catenin在细胞核中取代辅阻遏物Groucho，与T细胞因子(T cell factor，TCF)/淋巴增强因子(lymphoid enhancer factor，LEF)结合从而激活Wnt依赖的基因表达[11]。

2 中药单体抗结直肠癌的作用机制

2.1抑制肿瘤细胞增殖 白藜芦醇是来源于葡萄、虎杖、桑葚等植物的多酚类物质。王静宇等[4]用100 ng/mL的白藜芦醇处理结肠癌HCT116细胞48 h，结果显示细胞增殖被明显抑制，其机制可能与抑制β-catenin及Wnt/β-catenin信号通路靶基因c-Myc和细胞周期蛋白D1(cyclinD1)的表达有关。袁霜雪等[12]发现，采用不同剂量(20、40、60、80、100 μmol/L)的白藜芦醇干预结肠癌HCT116细胞可以剂量依赖性地抑制其增殖；进一步分析显示，白藜芦醇可以抑制TCF4/LEF报告质粒的转录活性，减少β-catenin蛋白和信使RNA(messenger RNA，mRNA)的表达。刘映孜[13]发现白藜芦醇可以抑制结肠癌HCT116细胞增殖，使细胞阻滞在G1期，其机制可能与白藜芦醇降低磷酸化GSK-3β蛋白水平、β-catenin mRNA表达水平和β-catenin/TCF4转录活性，抑制Wnt/β-catenin信号转导有关；此外，白藜芦醇也可促进细胞凋亡。

人参皂苷Rg3是从五加科植物人参中提取的一种四环三萜皂苷类物质，在红参中含量丰富，也可由人参皂苷Rb1、Rb2和Rd在一定条件下转化而成[14]。车章洪和何百成[15]分别用40、60、100、150 μmol/L的人参皂苷Rg3作用于结肠癌HCT116细胞72 h，发现药物浓度在60 μmol/L时，细胞增殖被明显抑制，且药物浓度越高，抑制作用越强；荧光素酶报告质粒检测和免疫荧光结果显示，人参皂苷Rg3可能通过阻止β-catenin的核转移而抑制β-catenin/TCF4转录活性和下游c-Myc蛋白的表达。何运元等[16]发现，人参皂苷Rg3可以抑制结肠癌HCT116和SW480细胞的增殖，诱导细胞凋亡，降低β-catenin磷酸化程度及减少β-catenin、c-Myc蛋白的表达，表明人参皂苷Rg3通过调控Wnt/β-catenin信号通路发挥作用。

雷公藤红素和雷公藤甲素是来自卫矛科植物雷公藤的三萜类化合物和环氧二萜内酯类化合物，两者均可抑制结直肠癌细胞生长。王術人[17]发现，雷公藤红素对结肠癌HCT116和SW480细胞生长的抑制具有时间和剂量依赖性，同时还可抑制肿瘤细胞克隆形成，促进细胞凋亡，且在C57BL/6J-ApcMin/+小鼠和氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠小鼠两种结肠癌动物模型中具有同样的效果；机制研究显示，雷公藤红素通过增强热激因子1的表达上调肝激酶B1的转录活性，肝激酶B1激活下游分子AMP活化蛋白激酶α，使Yes相关蛋白发生磷酸化，磷酸化的Yes相关蛋白进一步促进泛素化-蛋白酶体途径对β-catenin的降解，从而抑制Wnt/β-catenin信号通路。刘娟娟[18]发现，雷公藤甲素可以使结肠癌HT29和SW480细胞发生G1期阻滞，抑制细胞增殖，且具有剂量和时间依赖性，其机制与雷公藤甲素抑制Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin进入细胞核，减少下游靶基因LEF/TCF表达，抑制细胞转录和翻译有关。

粉防己碱又称粉防己甲素，是提取自防己科植物粉防己的一种二苄基异喹啉类生物碱。王东旭等[5]和吴柯[19]发现，粉防己碱可以诱导结肠癌LoVo细胞发生G1期阻滞，抑制细胞增殖，并通过过表达和沉默表达胰岛素样生长因子结合蛋白5验证了粉防己碱对结肠癌LoVo细胞的抑制与胰岛素样生长因子结合蛋白5的下调有关；深入研究表明，粉防己碱可能通过促进p53表达负性调控胰岛素样生长因子结合蛋白5的表达，进而干扰β-catenin/TCF转录活性和c-Myc的表达，抑制Wnt/β-catenin信号通路。刘映孜等[20]发现，粉防己碱可以抑制结肠癌HCT116细胞增殖，其机制可能与粉防己碱抑制Wnt/β-catenin信号通路中LEF/TCF4和c-Myc/Max转录活性及β-catenin蛋白的表达有关。此外，粉防己碱还可诱导结肠癌细胞凋亡。

姜黄素是从姜科植物姜黄中提取的一种多酚化合物。Jiang等[6]发现，姜黄素可以剂量依赖性地抑制结肠癌SW620细胞的增殖，促进细胞凋亡，并通过沉默表达尾型同源盒转录因子2，验证了姜黄素通过上调尾型同源盒转录因子2的表达而抑制β-catenin的核转运及Wnt3a和Wnt下游信号转导基因[c-Myc、生存素(survivin)、cyclinD1]的表达。刘英等[21]证实，姜黄素可以通过降低磷酸化β-catenin和Wnt3a的蛋白水平抑制Wnt/β-catenin信号通路中cyclinD1、survivin、c-Myc的表达，使结肠癌HT29细胞发生G0/G1期阻滞，从而抑制细胞增殖。

Falcarindiol为五加科刺人参属植物东北刺人参中的高含量炔醇化合物，其可以通过抑制Wnt/β-catenin通路中β-catenin、cyclinD1和c-Myc的表达，将结肠癌HCT116细胞阻滞在G2/M期而抑制其细胞增殖[22]。另有研究显示，马钱子中分离出来的马钱子碱亦可以通过上述途径抑制结肠癌SW480细胞的增殖[23]。

熊果酸是存在于人参、夏枯草、冬凌草等多种植物中的五环三萜类化合物，也可见于水果和蔬菜中[24]。邵英等[25]发现，熊果酸可以呈剂量和时间依赖性地抑制结肠癌HCT116细胞的增殖，诱导细胞发生G1期阻滞和细胞凋亡，并进一步通过过表达转化生长因子-β3(transforming growth factor-β3，TGF-β3)和特异性抑制TGF-β3证实了熊果酸是通过下调TGF-β3表达，降低Wnt/β-catenin转录活性来发挥作用。

吴茱萸碱是源自芸香科植物吴茱萸的一种生物碱。王元惠和周振华[26]研究发现，吴茱萸碱可以剂量依赖性地抑制结肠癌HT29细胞的增殖，将细胞阻滞在G0/G1期，其机制与吴茱萸碱减少Wnt和β-catenin mRNA的表达，进而抑制Wnt/β-catenin下游血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)(VEGFA、VEGFB、VEGFC)和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)(MMP-3、MMP-14)的表达有关。

和厚朴酚是木兰科植物厚朴中的一种新木脂素类化合物。吴柯等[27]用不同剂量(10、12.5、15、17.5、20 μmol/L)的和厚朴酚作用于结肠癌LoVo细胞，发现随着药物剂量的升高，细胞增殖率明显下降，同时和厚朴酚可以增强胱天蛋白酶(caspase)3蛋白的表达，促进细胞凋亡，且进一步研究发现和厚朴酚是通过抑制β-catenin/TCF4转录活性发挥作用。

汉黄芩素是从黄芩、半枝莲等植物中提取的一种黄酮类化合物。李彦萍等[28]研究表明，汉黄芩素对结肠癌SW480细胞增殖的抑制具有剂量依赖性，可将细胞阻滞在G1期，借助网络药理学发现其机制与汉黄芩素调控Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin、survivin、GSK-3β和Bcl-2相关X蛋白的表达有关。

此外，二氢丹参酮[29]、青蒿琥酯[30]、冬凌草甲素[31]、小檗碱[32]均可以通过下调β-catenin和(或)c-Myc的表达抑制Wnt/β-catenin信号转导来抑制结肠癌细胞的增殖。

2.2诱导肿瘤细胞凋亡 异补骨脂查尔酮是从豆科植物补骨脂中分离出的一种类黄酮类物质。Li等[33]发现，异补骨脂查尔酮可以通过调节凋亡相关蛋白(上调活化的caspase-3 、活化的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶，下调Bcl-2/Bcl-2相关X蛋白、X连锁凋亡抑制蛋白、survivin)的表达诱导结肠癌HCT116和SW480细胞细胞核形态改变，发生细胞凋亡，进而抑制细胞生长；进一步研究表明，异补骨脂查尔酮是通过抑制蛋白激酶B/GSK-3β信号转导促进β-catenin降解，从而调控Wnt/β-catenin信号通路。

重楼皂苷Ⅶ是从百合科植物重楼中提取出的甾体皂苷类成分。陈鸣旺等[34]对结直肠癌小鼠腹腔注射重楼皂苷Ⅶ，通过对肿瘤组织进行病理学检查发现，重楼皂苷Ⅶ可以通过上调凋亡相关蛋白(活化的caspase-3、caspase-8、caspase-9和Bcl-2相关X蛋白)表达，下调Bcl-2表达来诱导肿瘤细胞凋亡；此外，重楼皂苷Ⅶ还可以干预细胞周期相关蛋白的表达，并抑制Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin蛋白和八聚体结合转录因子4、性别决定区Y框蛋白2、c-Myc、TCF4基因的表达。

藤黄酸是藤黄科植物藤黄的主要活性成分。戴维等[35]采用不同剂量(0、1.5、3、6 mg/L)的藤黄酸干预结直肠癌Caco2细胞发现，细胞凋亡率随药物剂量的增加而升高，且细胞中活化的caspase-3、活化的caspase-9、Beclin 1、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ/微管相关蛋白1轻链3-Ⅰ水平升高，β-catenin、c-Myc水平降低，Wnt/β-catenin激活剂氯化锂可以逆转上述作用，表明藤黄酸是通过Wnt/β-catenin信号通路诱导细胞凋亡。

青蒿琥酯是菊科植物青蒿中青蒿素的一种衍生物。郭颖等[36]发现，青蒿琥酯可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路中TCF4/LEF的转录活性，上调GSK-3β，下调β-catenin和c-Myc的表达促进结肠癌LoVo细胞早期凋亡。

2.3抑制肿瘤细胞迁移和侵袭 菝葜皂苷是一种来源于中药知母中的皂苷元[37]。孙书凯等[38]分别用低、中、高剂量菝葜皂苷处理结肠癌HCT116和HT29细胞，并用划痕实验和Transwell小室法观察其对细胞迁移和侵袭的影响，结果显示菝葜皂苷干预后两种细胞的相对迁移距离减小，侵袭细胞个数降低，且具有剂量依赖性，同时细胞中β-catenin、c-Myc和TCF4蛋白的相对表达量降低，上皮钙黏素蛋白的相对表达量升高，表明菝葜皂苷通过抑制Wnt/β-catenin信号通路发挥抗迁移和侵袭的作用；此外，菝葜皂苷还可通过此途径抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。

木犀草素是存在于金银花、马齿苋、紫苏等多种植物和辣椒、胡萝卜、油橄榄等蔬果中的一种天然黄酮类化合物[39]。陈志成等[40]用10、20、40 μmol/L的木犀草素作用于LoVo细胞来源的结直肠癌干细胞样细胞，发现20和40 μmol/L的木犀草素可以明显抑制细胞侵袭转移，且具有剂量依赖性；进一步对Wnt/β-catenin/TCF4信号通路相关蛋白进行免疫印迹检测发现，木犀草素可以增强上皮钙黏素表达，抑制Twist、β-catenin、TCF4和MMP-2的表达。

芹菜素是存在于芹菜、葡萄、苹果等蔬果中的一种黄酮类化合物。张竹易[41]用30 μmol/L的芹菜素干预结肠癌SW480细胞24 h，发现其可以减少穿膜细胞，抑制40%的细胞发生迁移，对细胞侵袭的有效率达65%；进一步研究表明，芹菜素可以降低β-catenin mRNA和蛋白水平，促进β-catenin磷酸化，抑制β-catenin核转位，进而减少Wnt/β-catenin下游转移相关蛋白环加氧酶2、人类细丝蛋白形成增强子1、MMP-2的表达，并通过SW480异体移植瘤和肺转移瘤裸鼠验证了芹菜素抑制肿瘤生长和转移的作用。

此外，Ji等[42]研究发现白藜芦醇可以剂量依赖性地抑制结肠癌LoVo细胞侵袭和迁移，通过肺腺癌转移相关转录本1敲低和过表达发现，其机制与白藜芦醇下调肺腺癌转移相关转录本1进而抑制β-catenin的核转运及其下游靶基因c-Myc和MMP-7的表达有关。

2.4抑制肿瘤血管生成 大黄素是存在于大黄、虎杖、何首乌等多种植物中的一种单蒽核类二羟基蒽醌衍生物[43]。金剑和赵庆[44]分别用10、20、40 mmol/L的大黄素对结肠癌SW480细胞移植瘤裸鼠灌胃，发现大黄素可以降低小鼠血清促血管生成因子(VEGF、血管生成素2、碱性成纤维细胞生长因子)水平；免疫组织化学显示，肿瘤组织微血管密度和β-catenin表达水平亦下降，表明大黄素可能通过下调Wnt/β-catenin信号通路中的促血管生成因子表达来抑制移植瘤生长和微血管形成。

丹参酮ⅡA是唇形科植物丹参中的一种脂溶性化合物。刘宣[45]发现，环加氧酶2可以促进β-catenin核转运，激活Wnt/β-catenin信号通路并上调VEGF的表达，而丹参酮ⅡA可通过减少环加氧酶2的表达抑制肠癌细胞和移植瘤裸鼠肿瘤的生长及肿瘤微血管的形成。

2.5增强化疗敏感性 耐药包括内在性耐药和获得性耐药，其是导致化疗失败的常见原因，因此如何逆转化疗耐药、增强化疗敏感性是肿瘤临床治疗亟待解决的问题。王秋爽[46]用姜黄素联合5-氟尿嘧啶及顺铂共培养结肠癌SW480和SW620细胞，发现其对细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响均优于单独化疗，表明姜黄素具有协同化疗的作用；且机制研究显示，与单独化疗相比，联合用药可以增加Wnt/β-catenin信号通路中AXIN的表达，减少β-catenin、上皮细胞黏附分子、端粒酶逆转录酶和微管相关蛋白-1表达。魏培等[47]分别用青蒿琥酯、顺铂及联合用药处理结肠癌LoVo细胞，结果发现青蒿琥酯可以增强顺铂对肿瘤细胞的增殖抑制和凋亡诱导，逆转顺铂引起的β-catenin表达、β-catenin入核和TCF-1转录活性升高，表明青蒿琥酯可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路发挥对顺铂的增敏作用。

2.6抑制上皮-间充质转化 上皮-间充质转化与肿瘤的干细胞特性、侵袭迁移能力、化疗药物耐药等行为相关[48]。龙景培等[49]用不同浓度的冬凌草甲素干预结肠癌LoVo细胞发现，冬凌草甲素可以抑制细胞增殖和上皮-间充质转化，增加上皮标志物上皮钙黏素基因表达，抑制间充质标志物波形蛋白基因表达，上调Wnt/β-catenin信号通路中磷酸化GSK-3β(酪氨酸216)蛋白的表达，下调磷酸化GSK-3β(丝氨酸9)和β-catenin蛋白的表达，而加入GSK-3β抑制剂可以逆转冬凌草甲素对β-catenin、上皮钙黏素、波形蛋白的干预，表明冬凌草甲素可能通过影响GSK-3β活性来负性调控Wnt/β-catenin信号通路实现对肿瘤细胞增殖和上皮-间充质转化的抑制。

3 小 结

APC基因是家族性腺瘤性息肉病的主要原因，其在散发性结直肠癌中也有较高的突变频率，由于APC和β-catenin突变，导致大肠癌中与Wnt/β-catenin信号通路相关的经典基因突变超过90%[50]。因此，与其他肿瘤相比，Wnt/β-catenin信号通路在结直肠癌中的作用更为突出。中药单体可以通过Wnt/β-catenin信号通路干预肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭、肿瘤血管生成、化疗敏感性和上皮-间充质转化，进而在结直肠癌中发挥作用，但目前关于中药单体的研究仍需结合新的检测方法，不断深入探索机制，以为结直肠癌的新药研发提供基础。