超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道在心血管系统中作用的研究进展▲

尹 琳 黄从新

(武汉大学人民医院心内科，武汉大学心血管病研究所，心血管病湖北省重点实验室，湖北省武汉市 430060，电子邮箱：1727415874@qq.com)

【提要】 超极化激活的环核苷酸门控阳离子(HCN)通道为超极化激活的阳离子通道，受电压和环核苷酸双重调节。近期科学家利用低温电磁仪探索了HCN通道的某些特殊结构，为研究相关的离子通道特性提供了理论依据。HCN通道及其亚型在心脏中的分布具有一定的种属特异性，病理状态下各亚型的异常分布常常引起各类心律失常，另外HCN基因突变亦参与病态窦房结的形成。诱导多能干细胞作为一种新兴的具有潜在发展前景的干细胞，将为研究HCN基因突变及其参与心脏离子通道病变的病理生理和分子学变化提供良好的模型，且有利于针对HCN通道的特异性药物和生物起搏器的研发。

超极化激活的环核苷酸门控阳离子(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel,HCN)通道主要有以下特点:超极化激活、钠钾离子混合通道、电压及环核苷酸双重调节。目前，研究表明HCN基因参与心血管系统的心率调节和神经系统中神经元兴奋的调节。现就HCN通道在心血管系统中作用的研究进展进行综述。

1 HCN通道的结构

HCN通道包含4种亚型(HCN1、HCN2、HCN3和HCN4)，每个通道是由4个子单位围绕中央孔隙排列形成的1个四聚体，其中每个子单位内主要包括S1～S6的跨膜核心区域、位于胞质内的氨基端与羧基端3个部分。另外，羧基末端包含有环核苷酸结合的结构域(cyclic nucleotide-binding domain,CNBD)。最近，有学者利用低温电磁仪探索了HCN通道中的某些特殊结构，进一步阐释了该通道的某些基本特性[1-3]：(1)不同于经典构象的4个阳离子结合位点，HCN通道中编码的钾离子选择性过滤器为非经典构象，仅包含两个阳离子结合位点；另外，该钾离子选择性过滤器被酪氨酸所包围，仅允许两个钾离子通过。当HCN通道仅结合1个钾离子时，钠离子可轻易地采用非结合的方式通过该通道，进而产生内向电流。正常情况下，HCN通道的钠钾离子通透性的比值在1 ∶5～1 ∶3之间，且其通透比取决于细胞外的钾离子浓度。(2)跨膜蛋白S4、S5、S6呈螺旋状排列，其中S4螺旋的长度尤其明显，可延伸至胞质中的CNBD段。静息情况下，上述结构使得去极化电压传感器及门控通道均处于封闭状态；当细胞膜超极化时，电压驱动S4螺旋向下移位，打破了跨膜蛋白之间的稳定结构，因此S6螺旋自发地发生旋转，离子门控通道被打开。而Gross等[4]利用线性方程理论，更详细地阐述了环磷酸腺苷(cyclic 3′,5′-adenosine monophosphate,cAMP)结合如何在长距离上机械耦合以促进依赖电压的HCN通道的开放。(3)HCN通道中存在着一段高度保守的结构域，命名为HCND(HCN-domain)[5]。HCND段夹在电压感应区域和CNBD之间，并通过分子内部相互作用在电压感应区域和CNBD之间搭建起1个机械连续体，即电压感应区域和CNBD之间变构信息的相互传递可以直接通过HCND进行，从而有利于平衡电压及cAMP对HCN通道的双重调控。

2 HCN在心血管系统中的表达

窦房结中HCN及其各分型的转录水平在各种属之间具有较为明显的差异：在小鼠、兔子和人类的窦房结中以HCN4为主，其次为HCN1，HCN2表达量少，几乎检测不到HCN3[6-9]；但在犬科动物的窦房结中，HCN4与HCN2占主导地位；更令人惊讶的是在整个大鼠的生命周期中，HCN2在窦房结中的转录水平占据绝对的优势，其相对含量约为HCN4的8倍，几乎检测不到HCN1与HCN3的表达[10-11]。

但是，各种属心脏的总体HCN表达具有很多的相似点：首先，HCN总mRNA在心脏中的分布较为一致，窦房结最高，其次依次为房室结、浦肯野纤维，而在心室与心房中表达量较少，以心房最甚[6]；其次，成年后HCN总转录水平随年龄增长逐渐下降，但各房室中的比例基本上保持稳定[11]；再次，4种HCN在窦房结外的分布在各种属之间的差异性不明显，其中心房均以HCN1为主，而HCN2则主要出现于心室，其转录水平为HCN4的5～13倍，房室结和浦肯野纤维以HCN4与HCN1为主，且两者转录水平相近[6]；最后，HCN3目前未在出生后任何种属的心脏中被检测到，有相关研究报告其仅在小鼠早期胚胎发育阶段(孕龄9.5～15.5 d)的静脉窦区域可被检测到[7]。

在病理情况下心脏中HCN的分布发生明显改变。例如，充血性心力衰竭时窦房结中HCN的mRNA和蛋白质水平均降低，但在右心房中HCN4的表达上调至基线水平的2倍[10]。另外，在病态窦房结合并房性心动过速的犬模型中，窦房结中的HCN2、HCN4表达均明显降低，伴If电流振幅与频率降低，但其房性心动过速可能是由于HCN4与HCN2在心房中表达增加所引起的[12]。还有研究表明，心力衰竭时心室肌中HCN2的表达急剧上升，其能增加β受体阻滞剂的副作用，进而导致致死性心律失常[13]。

3 心血管系统中HCN通道的药理学研究

3.1 特效的减慢心率制剂 特效的减慢心率制剂(specific bradycardic agent,SBA)包括烯丙尼定、扎替雷定、西洛雷定、伊伐布雷定和ZD7288，其主要作用机制是通过抑制If电流，进而降低舒张期自动去极化，最终达到减慢心率的目的[14]。这些药物的一个重要特点是，其仅影响HCN通道的电流，而不调节该通道的电压依赖性。烯丙尼定和扎替雷定由于其严重的副作用，目前均已停产。

伊伐布雷定是目前唯一还流通于商业市场上的SBA，相较于其他SBA而言，其效应不作用于神经系统，因此无明显相关的不良反应。新近研究表明，对于β受体阻滞剂不能控制病情的急性心力衰竭患者，联合使用伊伐布雷定至出院，并维持使用至出院后180 d，能明显减慢患者的心率，而不影响β受体阻滞剂的疗效[15]。另有研究显示，伊伐布雷定不仅能降低心脏移植术患者的心率，维持其左心室射血分数，还可提高5年生存率[16]。临床大样本研究显示，尽管伊伐布雷定能维持心肌梗死患者的左心室收缩功能，降低心率，但进一步的长期随访却提示其可增加心血管不良事件的发生率，如心动过缓、新发房颤等[17-19]。因此，根据欧洲心脏协会制定的指南，伊伐布雷定被认定为收缩性心力衰竭和慢性稳定型心绞痛患者的B类治疗药物，其适用于最大β受体阻滞剂剂量治疗下心率仍>70次/min的患者[20-21]。

3.2 选择性HCN亚型抑制剂 近期发现的HCN亚型特异性抑制剂，如EC18、MEL57A，分别有选择性地作用于HCN4通道和HCN1通道。其中，EC18能特异性靶向作用于猪窦房结细胞中的HCN4通道，而MEL57A对神经系统中的HCN1通道表现出了显著的抑制效应[22-23]。另外，在狗的浦肯野纤维细胞中，EC18能减少If电流去极化的振幅与斜率，而MEL57A则对HCN4无明显作用[24]。

3.3 CNBD别构调节剂 Akimoto等[25]利用冷冻电子显微镜技术展示了在apo(即未结合cAMP状态下)的HCN4通道内CNBD的结构。他们进一步说明了HCN通道自身的平衡状态与cAMP相结合状态下的结构变化及动力学变化，其证实了带有apo HCN4 CNBD结构的二聚体可别构调节HCN4通道与cAMP之间的结合，因此认为这种别构调节剂可作为HCN通道的新型靶向抑制剂。

目前的研究表明，伊伐布雷定应用于心血管疾病时，仍可与其他离子通道相互作用而产生某些副作用。与靶向离子通道的药物相比，靶向CNBD的别构调节剂可以提供更具有选择特异性的HCN调节。事实上，药物靶向变构位点可能表现出较高的选择性。目前，对于这种别构调节剂作用的认识还处于初步假设阶段，仍有待进一步研究与开发。

4 HCN基因突变与病态窦房结综合征

目前，许多研究表明HCN4基因的突变参与病态窦房结综合征的形成。例如，Ishikawa等[26]检测到人类HCN4基因中编码S4电压门控通道的区域存在突变位点(R393H)，与心脏钠通道基因突变引起的病态窦房结不同，携带该突变的患者心电图不表现为心动过缓、房室传导阻滞、心房扑动等，外源性起搏器的植入率亦不高，其主要的临床表现为心房颤动和左心室致密化不全。HCN4基因G1097W突变体现为房室传导阻滞及反射性窦性心动过速，而D553N位点的错义突变导致HCN4通道蛋白不能被转运至细胞膜，心电图以长QT间期与尖端扭转性室速为主要表现[27-28]。

体外动物实验亦证实HCN4参与胚胎期窦房结的发育与出生后窦性心律的维持。例如，心脏特异性敲除HCN4基因的胚胎期小鼠是不能存活的，其大约在孕龄9.5～11.5 d的阶段出现胚胎致死性，而该阶段正是正常窦房结胚胎期的发育时间，因此可认为该胚胎致死性可能是由于窦房结未发育而造成的[29-30]。另外，在成年小鼠中，心脏特异性或全身性敲除HCN4基因或其中的某个表达位点(如573X位点)后，可检测到If电流振幅减少，体表心电图表现为反复地心脏停搏或窦性心动过缓[9,31-32]。

5 HCN通道应用于生物起搏

生物起搏就是体外利用基因重组的技术诱导起搏样细胞的形成，从而替代原来受损的起搏细胞，以使得病态窦房结综合征患者重新获得能够满足正常生命活动所需的心率。由于HCN4通道在心脏窦房结的心率调节中发挥着重要的作用，因此近些年来HCN通道被广泛应用于生物起搏的实验研究当中。由于HCN2通道比HCN4通道更容易激活，因此研究者倾向于选择HCN2作为生物起搏开发的起搏基因。前期的研究是通过直接将携带HCN2的腺病毒直接转染至犬的左心房或左束支，结果显示该注射位点确实能在一定程度上产生异位起搏点，但其起搏心率不高，未曾达到基础心率状态[33]。但有学者发现，HCN4活性与心肌细胞的钙调节有关，If电流升高会导致钙离子稳态失调，使得心室肌细胞过表达HCN4，从而引起细胞死亡和心脏重塑，最终导致心脏扩张和心脏功能受损[34]。

为了减少腺病毒直接作用于心脏细胞引起的免疫原性及HCN基因对心肌细胞的直接损伤作用，有学者将携带HCN2或者HCN4的腺病毒结合相关窦房结转录因子如TBX3，直接在体外感染各种类型的干细胞诱导起搏样细胞，如大鼠骨髓间充质干细胞、小鼠胚胎干细胞和人类诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)，结果显示，相较于单纯转染TBX3而言，TBX3联合HCN4或HCN2能明显增加体外诱导的起搏样细胞的搏动频率[35-37]。

6 小结与展望

随着科学技术的日新月异及学科之间的交叉融合，研究者对HCN4通道蛋白的结构功能与分子机制有了进一步的认识。尽管伊伐布雷定已经被作为收缩性心力衰竭和慢性稳定型心绞痛患者的B类治疗药物，但特异性靶向HCN通道某些区域的别构调节剂将有望成为新型HCN通道抑制剂。

人类胚胎干细胞和早期心脏祖细胞高转录HCN4与HCN1的mRNA，在这些细胞中均可检测到If电流的存在[38-39]。近几年，iPSC凭借着来源简单、近乎全项分化潜能、低免疫原性等优势，逐渐占据了干细胞基础研究的主导市场。目前，已在小鼠来源的多能干细胞和人 iPSC来源的心肌细胞中检测到HCN通道的表达[40]。尽管iPSC的功能及特性尚未被完全了解，但其已成为一种新兴的具有潜在发展前景的干细胞。心力衰竭和心律失常等病理状态下HCN通道在心脏中异常分布亦为心源性猝死的病因之一，因此我们可利用干细胞建立相关病理模型来深入进行机制学探讨及药理学开发。此外，许多研究表明HCN基因突变为病态窦房结综合征的病因学之一，利用干细胞全面探讨HCN通道及其突变的病理生理学变化和分子学变化过程，将有利于生物起搏器的进一步研发。