窦房结细胞形态学和组织学观察方法的现状

张磊　崔英健　陈华

摘 要：目的 窦房结是生物体心脏起搏点，因为窦房结的起搏，心脏才会收缩舒张，将血液泵至全身各器官组织。本文从取材方法、染色方法、观察技术、未来展望四个方面对窦房结细胞的形态学和组织学观察方法进展进行综述。

关键词：窦房结；组织学；形态学

中图分类号：R322.1 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.10.010

文章编号：1006-1959（2018）10-0030-04

Current Status of Morphological and Histological Observation of Sinoatrial Node Cells

ZHANG Lei1，CUI Ying-jian2，CHEN Hua1，ZHANG Fei1，ZHANG Yue1，ZHONG Qi1，LIU Shuang1，TAN Jian-ye1

Grade 2014，Clinical Medicine1，Department of Human Anatomy2，School of Medicine，Anhui University Of Science and Technology， Huainan 232001，Anhui，China）

Abstract：Objective Sinoatrial node is the pacemaker of biological heart， because the pacing of sinoatrial node will make the heart contract and relax，and pump blood into all organs and organs of the body.In this paper，the progress of morphological and histological observation of sinoatrial node cells was reviewed from four aspects：the method of taking material， the staining method，the observation technique and the future prospect.

Key words：Sinoatrial node；Histology；Morphology

隨着科技的发展，光镜-电镜的发明，人们对于心脏的形态学和组织学研究有了更进一步的研究。人们在面对以往束手无策的心脏传导系统疾病，有了人工瓣膜替换术和射频消融术，甚至可以用心脏移植来治疗疾病。而如今又有学者在动物体初步尝试自体窦房结细胞移植来治疗心脏部分心脏疾病，直到2013年张亚飞等[1]实验证明带蒂移植入自体心室的窦房结组织细胞可以和心肌细胞建立细胞连接，就此翻开了心脏窦房结研究的新篇章。由此可见，人们对心脏的认识不再仅仅局限于大体上，而是进一步发展到了显微、亚显微，甚至分子水平。本文就窦房结的形态学和组织学观察进展综述，以期有助于窦房结的形态学、组织学解剖和窦房结移植的发展。

1窦房结概述

窦房结（sinoatrialnode，SAN）是位于哺乳动物右心房上的一个特殊的小结节，由特殊的细胞构成。它可以自动地、有节律地产生电流，电流按传导组织的顺序传送到心脏的各个部位，从而引起心肌细胞的收缩和舒张，从而促使动脉血向远心端流动，同时促进静脉血回流。机体正常的心跳就是从这里发出的，这就是“心脏的正常起搏点”，窦房结就是心脏的主要起搏点[2，3]。窦房结细胞相当于一个“血泵”的发动机，启动整个心脏的跳动，使血液规律地在全身循环，供应全身各处的氧气和营养。

2取材方法的进展

动物体窦房结区定位、取材，是窦房结观察的关键步骤之一，因为取材、定位是否准确，将直接影响显微镜下窦房结细胞的观察。目前文献记载的窦房结组织取材定位大致有五类方法。

2.1根据窦房结的解剖位置来取材 即根据窦房结的解剖结构来定位取材。而动物与人的窦房结位置各有特点：人窦房结在上腔静脉和右心房交界处的界沟上1/3的心外膜深面。刘颖等[2]在人心窦房结组织获取中采用改良心脏传导系统解剖法。按照该位置，先从心脏静脉窦后方中线沿其长轴剪开，再从界沟左下方、与其平行相距1～1.5 cm处剪开直至越过右心耳嵴到其背后，用剪刀离断该组织与心房壁的连接处，即获得含有窦房结的组织块。王菲菲等[4]对心源性猝死患者窦房结细胞的特殊基因表达时，在人心脏窦房结位置获取窦房结组织。羊窦房结纵跨于上、下腔静脉口的全长之间，大多偏于界沟的腔静脉窦侧。张海东等[5]在介绍绵羊窦房结的取材时以该位置为指导获取窦房结组织。兔窦房结主要位于右房界沟的静脉窦侧，其长轴与界沟平行。祝瑜[6]等在兔窦房结的取材时按照该位置来取材，成功获得兔SAN。成年大鼠窦房结位于上（前）腔静脉与右心房交界区及交界区以上的上（前）腔静脉壁内，呈马蹄形。彭瑞云等[7]及刘燕青等[8，9]在成年大鼠窦房结的获取时，在该位置获得窦房结组织。方易冰等[10]在上腔静脉与右心房交界地明显搏动部位获取小鼠窦房结组织。狗窦房结位于界沟右侧，在腔耳角下方0.1～0.4 mm处向下延伸，赵欣等[11]在犬心脏腔耳角上方0.5 cm起点、界沟为中线，获取了窦房结组织。

2.2打结定位法和双酶解法 打结定位法是指在获取窦房结组织过程中，先找到上下腔静脉后，在两段用黑线打结标记，然后在两个线结间剪切以获取窦房结组织。高亚兵等[12]在做大鼠窦房结组织切片就是先打结定位，然后不断修剪，得到窦房结组织。双酶解法即是在打结定位法的基础上采用Ⅱ型胶原酶和弹性蛋白酶的无钙Tyrode液消化，以期在消化后，还能准确找到含有窦房结细胞的组织。殷春霞等[13]的豚鼠窦房结细胞分离中使用如上打结定位+双酶解法，成功提取窦房结细胞。田野等[14]在人胚胎窦房结细胞原代培养中，应用双酶解法，不同之处在于，先用较强的0.25%胰酶，再用0.1%的胶原酶作用。而在对照组中，先使用的是0.125%的胰酶。两者对照，结果发现前者取得较好结果，值得后来学者借鉴学习。

2.3解剖显微镜下分离窦房结组织，双酶解法 该方法是指在解剖显微镜下，确定窦房结大致位置，然后使用双酶解法，消化后准确提取窦房结细胞。高冬学等[15]乳鼠窦房结细胞的原代培养解剖显微镜下在上腔静脉，于界沟中部静脉窦侧、上腔静脉部（静脉开口以上）获得含有窦房结细胞的组织块。刘如秀等[16]在解剖显微镜下于界嵴中部静脉窦侧、前腔静脉根部取材，后再使用双酶解法。实验结果显示梭形细胞所占比例为60%左右，表明该取材方法较为可靠。

2.4以解剖显微镜为基础，用数码摄像机来辅助取材 这种方法是指在解剖显微镜的指导下，用数码摄像机记录获取组织的全过程。在术中使用数码摄像机的慢动作放映定位心脏最先开始搏动的位置，可在功能方面保证取材准确无误。另外，通过比较切除窦房结区前后动物心率的变化以确保完全切取窦房结组织。使用显微解剖技术精确获取SAN组织，可以避免过多切取非窦房结心肌细胞，提高获取组织中起搏细胞所占比例。该方法由魏益平在原代培养乳鼠窦房结细胞时提出，后暂无类似使用者。

2.5利用心外膜在体窦房结电图标测 在获取窦房结组织之前，用心电图各电极检测到特征性“P前波”后，在标测电极部位取材。刘启方等[17]利用以上方法获取精准取材后，再结合双酶解法对细胞进行提纯。而他们设置的对照组使用的是方法2.1（即按照SAN的解剖学位置取材）+双酶解法，观察结果经对比，两种取材方法有统计学意义，即获得了更多的窦房结细胞。

上述五种取材方法，各有利弊。前两种方法操作起来实用、简便，可用于病理诊断，但由于无法获得完整的窦房结组织，固不适用于精准的实验研究。后面三种固然能完整地获取窦房结组织，可操作复杂、费时费力，不宜应用于法医解剖和司法鉴定，但应用于精准的实验研究，可大大提高实验的可信度。

3染色方法的进展

3.1光镜下观察的染色方法

3.1.1组织切片的制作方法 应用普通的组织切片制作流程：固定、冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、表片、烘片等流程制作石蜡切片[15，18，19]。

3.1.2组织切片的染色方法 ①HE染色：脱腊、水化、染核、染质、脱水后封片，在光学显微镜下观察[20-22]。②Masson三色染色：切片脱蜡，然后水化；先用染色，稍冲洗；再用染色，浸洗2次；再用染色，0.25%醋酸水洗2次；最后用脱水，透明，封固切片。在光学显微镜下，用分化，直到心肌纤维清晰为止，并镜下观察[12，18，22]。

3.2电镜下观察的染色方法 将获取的组织块迅速固定（3%戊二醛溶液）、冲洗（0.01 mol/L PBS）、再固定（1%锇酸溶液）、再冲洗（0.01 mol/L PBS）、梯度脱水（依次通过50%丙酮、70%丙酮、90%丙酮、100%丙酮）、包埋（Epon812）、制作半薄切片、染色（甲苯胺蓝试剂）、在光学显微镜下观察半薄切片并定位选择（细胞小、界限不清、染色淡的细胞集团）、再切片（超薄切片机切半薄切片）、双重染色（醋酸铀和枸橼酸铅）、电子显微镜下观察并拍照、记录[1，7，15，20]。

3.3免疫荧光染色 免疫荧光染色是指在切片制作后，使用荧光物质对组织特定部位进行染色后，在荧光显微镜下观察的方法。具体举例如下，培养的窦房结细胞，清洗（PBS液）3次，室温下固定（40 g/L多聚甲醛液）30 min，清洗（PBS）后滴加山羊血清，孵育（37 ℃保温箱）30～40 min，吸掉液体；滴加超极化激活环核苷酸门控阳离子通道（HCN）4一抗（按1∶150稀释），并用PBS做阴性对照。孵育（4 ℃冰箱）过夜，次日清洗（PBS）后滴加山羊抗兔IgG-FITC荧光二抗（按1∶100稀释），孵育（37 ℃保温箱）40 min，清洗（PBS）后封片（缓冲甘油）[4，17，20，21]。张海东等[5]在体内外获取心脏起搏细胞时，使用了免疫荧光染色的方法。但在染核時使用DAPI试剂，再在荧光倒置显微镜观察；更是使用HCN4来给窦房结上离子通道做个标记。

4观察技术的进步

随着科技的发展，新的显微镜的出现，人们观察到的细胞结构也从显微结构过渡到了亚显微结构，甚至分子结构。窦房结细胞大都一致，可窦房结的大小、形态、位置也跟物种有关。下面有几种观察的方法，分别在每种观察方法后，各举一例。

4.1光镜（光学显微镜）观察 光学显微镜可以观察到细胞的外形与微小血管的管壁等结构，故可用来观察窦房结的显微结构。刘颖等[2]在人心窦房结解剖中观察到人心窦房结外形多呈长梭形（或半月形），位于上腔静脉与右心房交界处的界沟上1/3的心外膜深面，从心外膜表面用肉眼不易辨认，结的长轴与界沟基本平行。窦房结内恒定地有窦房结动脉穿过其中。窦房结内的细胞主要有起搏细胞（pacemakercell）和过渡细胞（transitionalcell），还有丰富的胶原纤维，形成网装支架。

4.2电镜（电子显微镜）观察 电镜即电子显微镜，可以观察到细胞内部结构，比如核仁、线粒体、高尔基复合体等亚显微结构，故可用来观察窦房结细胞的内部结构。P细胞的特点如下：细胞器少、细胞核大，核呈圆形或椭圆形，近核膜有染色质凝聚，线粒体少，高尔基体发达，位于核旁。T细胞胞的特点：核呈长圆形，线粒体较多，可见较完整的肌节，细胞间连接多为中间连接。

4.3荧光生物显微镜 荧光生物显微镜，利用荧光标记物对细胞膜特定结构进行标记，然后有助于观察膜结构的特点及分布。王志等[20]在乳鼠窦房结细胞原代培养中观察到梭形细胞的细胞膜上分布有HCN4抗原，表现为较连续的荧光团，胞质中也有HCN4抗原的分布。三角形细胞中可见HCN4抗原的表达，只是数量不多。

4.4三维立体重建 在光镜观察的基础上，有人应用了现代计算机技术对窦房结细胞进行了三维立体重建，更加形象地观察窦房结的结构。如李凤霞等[19]使用了Amira 4.1.1 技术对绵羊窦房结进行三维立体重建，发现绵羊的窦房结在外部形态上与人类及其他哺乳动物存在较大的差异性。

4.5微CT观察 利用微CT成像技术对窦房结的形态进行观察研究，

5存在的问题与展望

存在的问题：①窦房结定位取材困难：尽管上述很多方法用于窦房结取材，可仍因窦房结位置变异性很大而无法精准定位取材，无法观察窦房结组织在体的情况，以及在体的准确定位研究；②窦房结组织获取困难：实验中只能在离体的死亡标本上获取窦房结组织，并不能直接在活体上提取部分窦房结组织；③窦房结组细胞获得不易：自体窦房结组织移植治疗病态窦房结综合征目前仅在基础实验阶段，且自体窦房结组织获取不易，而异体窦房结移植或异种异体窦房结移植、甚至人工窦房结移植，因找不到合适的供体还未曾有相关的文献记载；④异体窦房结细胞植入机体会产生严重的排斥反应：虽然已经证实能够与机体心肌细胞建立联系，但存活率太低。目前想要应用于临床不现实。

问题是客观存在的，我们要敢于直面问题，解决问题。期待未来人类能解决上述问题，真正达到窦房结移植或替换术，以彻底解决窦房结功能结构异常引起的心脏病。

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收稿日期：2017-12-8；收稿日期：2018-2-1

编辑/杨倩