枣疯病发生机制与防治研究进展

李继东， 陈立川， 王会鱼， 陈鹏， 杨琦琪， 张玉， 李奇承， 冯建灿

(1.河南农业大学林学院，河南 郑州 450002；2.河南省果树瓜类生物学重点实验室，河南 郑州 450002；3.郑州师范学院生命科学学院,河南 郑州 450044；4.河南农业大学园艺学院，河南 郑州 450002)

枣(Ziziphusjujuba)是中国重要果树，已有千余年的栽培和利用历史[1]，2018年全国干枣产量547.3万t[2]，是第一大干果树种。枣疯病是由枣疯病植原体(Canidatusphytoplasmaziziphi)引起的一种致死性传染病害，发病树产生丛枝、黄化、小叶、花器变叶等症状，逐渐枯死，对枣产业可持续发展造成极大危害[3-4]。近年来，由于红枣效益下降，枣园缺乏管理，传统枣区的枣疯病发生日益严重。本文综述了枣疯病发生机制和防治的研究进展，就发病分子机制、精准施药和物理防治等研究方向提出了展望，能够为枣疯病发生机制和防治提供参考。

1 枣疯病发生机制及研究现状

1.1 枣疯病病原及传播途径

1.1.1 枣疯病病原鉴定 1950年，王鸣岐[5]出版的《河南植物病害名录》中记载了枣“丛叶病”，将其归为病毒病类，并记载了1939—1941年在新郑、登封、潭头、南阳、灵宝等地采集有标本。1951年，季良[6]首次正式报道了枣疯病，描述其病症为“叶的丛生，与花器的退化，叶的黄变，冬季不落叶等情况”，发现该病具有传染性，认为可能是一种病毒病害。

HONG等[7]、KIM[8]、翁心桐等[9]、王清和等[10]分别进行了病症观察、嫁接传病试验，证实了枣疯病可以通过嫁接传病，认为病毒是引起发病的病原体。王清和等[10]还在病叶表皮细胞内观察到了五角形结晶体。

1967年，DOI等[11]从桑树萎缩病、马铃薯丛枝病和泡桐丛枝病病株筛管中发现了类菌原体(Mycoplasma-like organism, MLO)，后来被证明为植原体(Phytoplasma)。1973年，YI等[12]在感染枣疯病叶脉筛管中观察到了植原体。1974年，中国科学院上海生物化学研究所病毒研究组和山东省果树科学研究所枣疯病研究组[13]用电子显微镜在枣疯病树叶中检查到棒状质粒，在健康对照叶片中未见到，认为是枣疯病病原体；此外在枣疯病树叶和对照健康叶片中，还观察到细纤维状质粒，在感病组织中有增加趋势，认为枣疯病是由类菌原体和病毒共同引起的。王祈楷等[14]分析了病树根部和疯枝韧皮部匀浆提纯物，认为枣疯病是由类菌原体单独引起。

在1994年召开的第十届国际菌原体组织(International Organization of Mycoplasma，IOM)大会上，植原体被定义为柔膜菌纲的一个属[15]。虽然有成功培养的报道[16]，但植原体培养条件苛刻，人工培养十分困难，这也限制了对其分类定名和发病机制的研究。目前植原体仍采用候选种(Candidatus)的分类系统命名，枣疯病植原体命名为Candidatusphytoplasmaziziphi[17]。

除了通过对植原体的显微观察外[13,18]，酶联免疫技术(ELISA)也曾用于枣疯病植原体的检测[19-20]，但这些技术都较为复杂。采用二脒基苯基吲哚(DiAmidino PhenylIndole，DAPI)对植原体进行荧光染色可以有效对植原体进行定性和定量检测[21]。通过DAPI染色，研究了植原体在病树上的分布规律[22-23]。聚合酶链式反应(PCR)技术问世后，LEE等[24]开发了植原体16SrDNA序列扩增的通用引物，PCR技术也被用于枣疯病植原体的检测上。NAMBA等[25]首先报道了枣疯病植原体16SrDNA序列的扩增和测序，何放亭等[26]首先在国内开展了PCR检测枣疯病植原体的研究，TIAN等[27]建立了枣疯病植原体16SrDNA的巢式PCR和RFLP分子检测体系，此后PCR技术被广泛应用于枣疯病的检测和分析上[28-29]。

1.1.2 基于16SrDNA的枣疯病植原体分类 16SrDNA编码微生物核糖体上的16SrRNA，序列具有相对保守性，常用于细菌等微生物鉴定、进化分析和分类。LEE等[24]根据16SrDNA的RFLP分析，将北美的40种植原体分为9组14个亚组。ZHU等[30]用PCR扩增并测序了枣疯病植原体的16SrDNA序列，认为枣疯病与樱桃致死黄化病的植原体亲缘关系紧密，与榆树黄化病植原体关系较近但有差别，这两者在分类上应属于榆树黄化组(第V组)的一个新亚组。JUNG等[17]通过对来自日本和韩国4个地区的病枣样本，及GeneBank中其他44个植原体16SrDNA序列进行对比，认为枣疯病植原体为一个单独的种，定名为CandidatusPhytoplasmaziziphi，属榆树黄化组。随着越来越多的植原体被发现，现在植原体属已经有36个组，枣疯病植原体仍属于榆树黄化组[31-32]。

1.1.3 媒介昆虫 植原体病害靠刺吸式昆虫传播，主要是叶蝉类。中国叶蝉科有94属220种[33]，在枣树上寄生的有片突菱纹叶蝉(Hishimonuslamellatus)、凹缘菱纹叶蝉(Hishimonussellatus)、小绿叶蝉(Empoascaspp.)、斑叶蝉(Erythroneurasp.)、横带叶蝉(Scaphoideusfestivus)、大青叶蝉(Cicadellaviridis)、新县长突叶蝉(Batracomorphusxinxianensis)、红闪小叶蝉(Zyginasp.)、白边大叶蝉(Kollapaulula)、桃一点叶蝉(Singaporashinshana)、一点木叶蝉(Phlogotettixcyclops)、条沙叶蝉(Psammotettixstriatus)、窗耳叶蝉(Ledraauditura)等[34]，以及橙带拟菱纹叶蝉(Hishimonoidesaurifascialis)[35]，目前已证实为枣疯病植原体介体昆虫的有凹缘菱纹叶蝉(Hishimonussellatus)[34]、橙带拟菱纹叶蝉(Hishimonoidesaurifascialis)[35]，片突菱纹叶蝉(Hishimonuslame-llatus)、大青叶蝉(Cicadellaviridis)和白边大叶蝉(Kollapaulula)等[36]。

1.2 枣疯病发病过程中植株生理生化变化

关于枣疯病发生后植株生理生化变化的研究，集中于营养物质、次生代谢物、激素含量和光合作用变化等方面。莽克强等[37]研究表明，枣疯病叶中游离氨基酸总量高出健康叶10～15倍，谷酰胺和天门冬酰胺含量高出健康叶4～5倍，精氨酸也出现不正常的积累，疯枝上的健康叶也有不正常的变化。赵锦等[38]研究了枣疯病树中内源激素含量变化，结果表明，健康和发病树叶内IAA、GA3和ABA的含量没有区别，生长后期病叶中玉米素的含量显著高于健康株。

刘雅倩等[39]研究了植原体侵染对枣树叶绿素含量的影响，结果表明，大田条件下，‘赞皇大枣’病叶的叶绿素含量及叶绿素a/b值显著低于健康叶片，在培养基中添加IBA、6-BA可以提高发病‘婆枣’组培苗的叶绿素含量，促进病苗的光合作用。LIU等[40]研究了抗病品种‘星光’与感病品种‘婆枣’在植原体侵染后的光合作用相关指标变化，结果表明，感病品种的叶绿素和类胡萝卜素含量在植原体侵染后期显著降低，而抗病品种在侵染初期显著升高。与未感染植株相比，抗病品种在侵染初期的主要光化学参数(Fv/Fm、ΦPSII和qP)显著降低，而这种情况在感病品种中在侵染后期才会出现。

1.3 枣疯病发病过程中基因表达变化

随着分子生物学技术的发展，荧光定量PCR、抑制消减杂交(Suppressive Subtraction Hybridization, SSH)、基于高通量测序的转录组和蛋白组等技术开始应用于枣疯病研究，测定发病过程中的基因表达变化，以确定与发病相关的关键基因。

LIU等[41]构建了抗枣疯病品种‘星光’植原体胁迫的抑制消减杂交SSH 文库，从200个单独序列标签中注释了77个基因，RT-PCR表明TLP、PR10、HSP70、ERF和激酶相关蛋白在不同的植原体侵染时期上调。在此基础上，又先后对从SSH杂交中筛选出的谷胱甘肽转移酶ZjGSTU1基因[42]和真核生物翻译延伸因子ZjeEF-1α基因[43]进行了克隆、表达特性和功能分析，初步探讨了这些基因在对枣疯病抗性中的作用。

2014和2016年，LIU等[44]和HUANG等[45]先后完成了灰枣和骏枣的基因组测序，为枣分子生物学研究提供了丰富的数据资源。在此基础上，先后鉴定了枣的MADS-box转录因子家族[46]、分裂源蛋白激酶系列(Mitogen Activated Protein Kinase, MAPK, MAPKK, MAPKKK)基因家族[47-48]、碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)转录因子家族[49]、碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper, bZIP)转录因子家族[50]，并通过转录组分析和RT-PCR检测了这些基因在枣疯病发生中的变化，筛选出了一些对植原体侵染有响应的基因[51]。

SHAO等[52]用高通量测序技术分析了健康和感病枣树的miRNA表达差异，发现了12个上调和10个下调2倍以上的miRNA，对其下游标靶基因进行了预测。此外，还鉴定了ZjSPL转录因子家族的18个成员，其中11个为miR156的靶标，8个与植原体侵染响应有关[53]。FAN等[54]通过对比健康和感病枣树的转录组，在叶片文库中筛选出4 266个差异表达基因(Differentially Expressed Genes, DEGs)，在花文库中筛选出3 800个DEGs，认为其中与氨基酸代谢和类胡萝卜素途径相关的基因与枣疯病导致的营养缺乏、黄化、丛枝和小叶相关。SUN等[55]鉴定了枣赤霉素响应因子(Auxin Response Factor, ARF)基因家族的16个成员，其中5个在植原体侵染后差异表达，ZjARF4是miR167、miR529和miR2950等miRNA的直接标靶，可能与枣疯病株的花发育相关；此前，他们还研究了枣中长末端重复拟转座子(Long Terminal Repeats, LTR-retrotransposon)对植原体侵染的转录激活差异[56]。

YE等[57]、WANG等[58]和WANG 等[59]针对健康枣嫁接病芽的枣疯病发生过程和用四环素处理组培枣苗的治愈过程进行了转录组和蛋白组组合分析，发现茉莉酸途径在枣疯病发生和治愈过程中起重要作用，此外还鉴定了枣NAC[60]、WRKY[61]、TCP[62]、AP2/ERF[63]等转录因子家族的成员，并分析了它们在枣疯病发生和治愈过程中的表达动态。

1.4 枣疯病植原体基因组及致病因子研究

1.4.1 枣疯病基因组核酸分离及测序 由于无法人工培养，在植原体基因组测序时只能将其与寄主植物或昆虫的DNA一起提取，再进行分离。植原体的DNA富含A/T，分子大小比植物或动物寄主小，因此可以用氯化铯密度梯度离心，或双向脉冲电泳等方法将其与真核生物寄主的DNA分离开来。陈昱圻等[64]、傅强等[65]、刘玲雪等[66]分别报道了用氯化铯密度梯度离心和双向脉冲电泳分离出枣疯病植原体DNA。

2018年，WANG等[67]成功测序枣疯病植原体的NKY株系，其序列总长750 803 bp，G/C含量23.3%，有694个蛋白编码基因，2个rRNA基因，31个tRNA基因，4个潜在移动元件(Potential Mobile Units, PMUs)。董雅容等[68]报道北京农学院测序了一个冬枣植原体序列(JWB-Dongzao)，但数据尚未公开发表。

1.4.2 枣疯病致病因子预测及效应 致病因子是病原微生物分泌的效应蛋白，可以和寄主体内的标靶蛋白互作，进而干扰寄主体内的转运、基因表达和防御反应等许多细胞内过程[69]。枣疯病植原体基因组的测序完成，为开展致病因子分析奠定了基础。唐嫣[70]分析了JWB-NKY株系的基因组序列，从中预测获得28个潜在致病因子，其中JWB406和JWB157分别引起丛枝和花变叶症状，通过cDNA文库初步筛选了与这些致病因子互作的寄主蛋白。屈晓逸[71]也从枣疯病植原体基因组中预测了11个潜在的致病因子蛋白。

膜蛋白在植原体的代谢和致病机制中也起着非常重要的作用，高瑞等[72]克隆并分析了枣疯病植原体免疫膜蛋白(Immunodominant Membrane Protein，IMP)基因，董雅容等[68]从JWB-Dongzao序列中分析并克隆到一个免疫优势膜蛋白基因imp-DZ，去掉跨膜区域后在大肠杆菌中表达，为开展植原体与寄主植物互作机制研究提供了依据。

2 枣疯病防治研究现状

2.1 枣疯病抗病品种的选择

中国枣种质资源丰富，不同品种间对枣疯病的抗性表现不同。任国兰等[73]研究发现，灰枣、扁核酸为感病品种，灵宝枣和九月青抗病，鸡心枣、广洋枣介于中间。田国忠等[74]调查发现，婆婆枣和洪赵小枣有高度抗性，而梨枣和扁核酸则为感病品种。赵锦等[75]从29份抗病种质资源中选择出骏枣、南京木枣、秤砣枣和清徐圆枣等4个高抗单系，肖京等[76]从27个骏枣品系中选择出4个高抗品系，田国忠等[77]从46个枣品系中选择出骏枣、壶瓶枣两个高抗品系，赵进红等[78]选育出4个抗枣疯病品种，其中岱健枣和岱康枣获得国家植物新品种权，泰山圆红枣和泰山长红枣通过山东省林木良种审定，刘孟军等[79]从骏枣变异单株中选择出来的高抗品种星光，通过河北省林木品种审定委员会审定，将星光嫁接到感病的婆枣砧木上，嫁接后98 d，星光中用PCR检测不出植原体[80]。

2.2 枣疯病的物理防治

物理方法截断植原体传播途径，是枣疯病防治的有效措施。因此，在未阐明枣疯病病原时，就总结出了砍伐病株，减少传染源的防治方法[9-10]，后又发现，环剥能阻止病原物的运转，剪除疯枝能治愈初发病的病树[81]。植原体没有细胞壁，对环境变化敏感，因此采用高温和低温处理均能对其有杀灭作用[82-83]。戴洪义等[84]开展了热处理植原体脱毒苗的培育，用50 ℃的热水处理枣疯病枝10～20 min后扦插，能生长出健康的苗木。WANG等[85]开展了茎尖超低温冷冻去除枣疯病植原体的研究，将带病茎尖预培养后，用培养基包埋，然后置于液氮中处理1 h，经卸载液处理后，再生的芽PCR检测不到植原体。

2.3 枣疯病的化学防治

植原体是革兰氏阳性致病微生物，对四环素类抗生素敏感，因此自20世纪70年代起，就开展了四环素类抗生素用于枣疯病治疗的研究。王焯等[86]利用盐酸四环素、土霉素碱等进行病树注干治疗，取得了明显疗效。王祈楷等[14]利用土霉素和四环素打孔注药，也取得了明显效果。赵锦等[23]对植原体在病树体内的分布特点和周年消长规律进行研究，提出4月底至5月初展叶期是药物治疗的最佳时期。赵进红等[87]开展了枣疯病大田防治药物的筛选研究，结果表明，四环素、土霉素、螺旋霉素和红霉素等4种抗生素均能在一定程度上控制枣疯病情，土霉素的防治效果最好。

近年来，中草药在植物病害防治中的应用得到发展，赵伟[88]开发了以黄芩(Scutellariabaicalensis)、黄檗(Phellodendronamurense)、狼毒(Euphorbiafischeriana)、闹羊花(Rhododendronmolle)等23味中草药保护液，采取树干注射、花期喷雾、粉剂埋根等方法，治疗枣疯病效果良好。

2.4 枣疯病综合防治策略

预防为主，综合防治，一直是枣疯病治理的原则，从园地选择、苗木和接穗检验检疫、抗病品种应用、病树治疗及康复、防治传毒昆虫等多方面来解决问题[3]。除了技术层面对枣疯病综合防治进行研究外，对病害发生的主导因素、病情分级、防疫风险等也进行了研究。田国忠等[74]对北京、陕西、河南、山西、安徽和浙江等枣区发病情况进行调查，提出高比例的无症状带菌根蘖苗传病和不利于枣树生长的环境压力是导致许多地区病害流行和加重的主导因素。刘孟军等[89]根据病原浓度、症状表现和病情可控程度等，提出了组织、单枝、单株、枣园和枣区5个水平的病情分级指标，为枣疯病的防治提供参考。新疆目前是中国最大的枣产区，张静文等[90]通过对枣疯病分布情况、潜在危害性、寄主种类、传播方式、根除难度等方面定性和定量指标的综合分析评估，认为枣疯病植原体属于特别危险性林业有害生物，一旦传入流行将给新疆枣产业发展带来巨大经济损失，并提出了加强检疫、加强枣园管理、增强树势、防虫治病、控制菌源、手术和药物治疗的综合防治措施。韩剑等[91]研究了南疆阿克苏、喀什地区的枣疯病发生情况进行调查，分析认为，无症带菌苗人为传播是导致枣疯病传播的主要原因，并认为改善园内土壤理化性质、清除杂草灌木等潜在寄主有助于枣疯病防治。

3 枣疯病研究存在的问题及展望

植原体是现今发现的唯一一类能同时寄生于动物(昆虫)和植物体内的病原体，植原体分泌的致病因子导致植物产生丛枝、花变叶等幼化症状，有利于刺吸式昆虫的取食，同时有利于植原体的传播。植原体病害的发生牵涉寄主植物、叶蝉、植原体三者的协同进化和平衡关系[92]。枣疯病植原体基因组的成功测序为从分子水平上深入剖析其致病机制，进而开展药物开发、抗病品种培育奠定了基础。目前对枣疯病植原体致病因子功能的研究已取得初步进展，深入对枣疯病植原体致病因子和其他致病蛋白进行研究，对于揭示枣疯病发生分子机制和防治都有重要意义。

对症施药是病害防治的关键，农药减量化是国家的政策要求，也是生态环境保护的需要，目前对枣疯病植原体和抗生素之间的定量关系上尚缺乏研究，利用分子定量技术，开展枣疯病定量用药防治研究，对于减少化学防治中的抗生素用量，实现精准施药有一定价值。

枣疯病植原体没有细胞壁，对环境变化敏感，目前已有对枣疯病冷冻处理脱毒研究的报道，国外有报道采用高温方式培养植原体脱毒苗，开发更多物理防治的技术和设备，对于枣疯病无公害防治也有现实的意义。