N6-甲基腺苷修饰在心脑血管疾病中的研究进展

叶维贞，刘向荣

心脑血管疾病在全球的病死率长期位于前列。数据显示，心脑血管疾病是中国非传染性疾病死亡的首要原因[1]。N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）是RNA转录后一种重要的表观遗传学修饰。研究发现，m6A修饰与心脑血管疾病的发生发展密切相关[2]。因此，本文对m6A修饰及相关调控蛋白在心脑血管疾病发生发展中的作用进行综述。

1 m6A修饰概述

1.1 m6A修饰的特点及功能 迄今已发现170多种RNA表观修饰，主要包括m6A、N1-甲基腺苷、5-甲基胞苷等，其中m6A是真核生物信使RNA（messenger RNA，mRNA）丰度最高的内部修饰[3]。1974年，Desrosiers等[4]在Novikoff肝癌细胞mRNA的甲基化核苷中发现了m6A修饰。后续研究发现，m6A不仅存在于酵母、植物、哺乳动物等真核生物中，还存在于病毒、细菌、支原体中[5]。m6A修饰的位置通常具有高度的序列保守性，更倾向在RRACH（R=A、G；H=A、C、U）基序上。对mRNA m6A修饰富集的位置进行分析，发现其在序列编码区（coding sequence，CDS）和3’非翻译区（3’ untranslated region，3’UTR）丰度较高，而且在两者交界区域，终止密码子附近有一个最高峰值，这种位置的分布特异性提示m6A修饰很可能具有特殊功能。

目前发现，若m6A修饰发生于5’非翻译区，则能够促进转录本5’帽端非依赖性的蛋白翻译[6]。若m6A修饰仅发生于3’UTR，则能够与YT521-B同源结构域家族蛋白（YT521-B homology domain family，YTHDF）1结合，进一步招募翻译真核起始因子3（eukaryotic translation initiation factor 3，eIF3），促使5’帽端和3’poly尾端形成环状结构，进而促进5’帽端依赖性的蛋白翻译[6]。若m6A修饰发生于CDS或3’UTR，则能够与YTHDF2结合，进一步缩短RNA 3’poly尾端，促进mRNA降解[6]。另外，发生于CDS或3’UTR的m6A修饰位点也能与胰岛素样生长因子2信使RNA结合蛋白（insulin-like growth factor 2 mRNA binding proteins，IGF2BPs）结合，招募RNA结合蛋白人抗原R或Matrin 3蛋白，提高mRNA稳定性[6]。因此，m6A修饰调控mRNA的方式有多种，如调控mRNA前体的可变剪切、影响与微小RNA（microRNA，miRNA）结合效率、影响蛋白翻译效率及mRNA稳定性等[7]。

m6A不仅存在于mRNA，也存在于其他各种非编码RNA上，包括长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）、环状RNA（circular RNA，circRNA）及miRNA等。与mRNA不同，m6A在lncRNA上更倾向于在整体转录本上平均分布，无特别的位置分布且功能上也存在差异，其功能包括降低lncRNA的稳定性和调控lncRNA结合miRNA[8-9]。对于circRNA，m6A修饰可降低circRNA的稳定性，促进circRNA出核及翻译多肽、调控细胞固有免疫[10-11]。在miRNA中，m6A可促进miRNA前体的可变剪切，并可与miRNA联合调控基因的表达[12]。

1.2 m6A修饰相关酶 m6A修饰是一个动态且可逆的过程[13]，主要由三种催化酶实现，分别为m6A甲基转移酶、m6A去甲基化酶及m6A结合蛋白。

m6A甲基转移酶也称m6A编码器，RNA可由甲基转移酶复合体介导甲基化修饰。甲基转移酶复合体由多种蛋白复合形成，包括甲基转移酶3（methyltransferase-like 3，METTL3）、甲基转移酶14（methyltransferase-like 14，METTL14）、Wilms肿瘤1-相关蛋白（Wilms’ tumor 1-associating protein，WTAP）、RNA结合蛋白15等。METTL3是最主要的m6A修饰蛋白，METTL14辅助其结合底物[14]。而WTAP定位于METTL3-METTL14异二聚体，可提高催化活性。RNA结合蛋白15可与富含U的序列结合，使该序列附近的RRACH基序更易发生m6A修饰[15]。

m6A去甲基化酶又称“消码器”，主要包括脂肪和肥胖相关蛋白（fat mass and obesity associated protein，FTO）和α-酮戊二酸酯依赖性双加氧酶同系物5（α-ketoglutarate dependent dioxygenase alkB homolog 5，ALKBH5）。与甲基转移酶的作用方式不同，去甲基化酶通常由一个蛋白即可发挥去除m6A修饰的作用。FTO是最早被发现的m6A去甲基化酶，可以在细胞核和细胞质中去除m6A修饰，主要与肥胖和代谢有关；ALKBH5主要在细胞核中发挥作用[16]。

m6A结合蛋白又称“读码器”，目前发现，m6A结合蛋白通过直接或间接结合RNA发挥作用，且一个m6A RNA转录本如果结合不同的“读码器”，后续会产生不同的反应。直接结合RNA的“读码器”一般有一个专门识别m6A修饰的特定结构域，如YT521-B同源（YT521-B homology，YTH）结构域家族识别蛋白，其包括YTHDF1、YTHDF2及YTHDF3。当m6A RNA转录本与YTHDF2和YTHDF3结合时，会促进其降解；当m6A RNA转录本与YTHDF1和YTHDF3结合时，能够促进蛋白翻译[17]。此外，有些m6A结合蛋白不含特定识别结构域，只含有普通RNA结合域，如IGF2BPs和eIF3。当m6A结合蛋白与IGF2BPs结合后，将维持RNA转录本的稳定性[18]；与eIF3结合后，可以促进翻译的启动[19]。

2 m6A修饰与心脑血管危险因素

m6A可直接或间接地参与心脑血管疾病的发生发展。研究表明，m6A与心脑血管疾病的危险因素及其发生发展过程中的病理变化有关，如高血压、高血脂、糖尿病、超重和肥胖等[20]。

2.1 高血压 高血压是心脑血管疾病的主要危险因素之一。Mo等[21]研究了m6A相关的单核苷酸多态性（m6A-associated single nucleotide polymorphism，m6A-SNP）与血压在大规模全基因组研究中的关联，发现较多m6A-SNP均与血压相关，而且在甲基化位点附近的m6ASNP会导致m6A甲基化位点的增加或减少，推测可能因为单核苷酸多态性影响了m6A甲基化或转录的错义突变及变异，但还有待验证。总之，m6A-SNP在血压调节中可能发挥一定作用，但具体机制尚未明确。

2.2 2型糖尿病 2型糖尿病约占糖尿病的90%，研究表明m6A修饰与2型糖尿病密切相关[22-23]。研究发现，m6A水平升高可刺激大鼠脂肪细胞的葡萄糖氧化，降低葡萄糖浓度，提示适当水平的m6A才能维持适当的葡萄糖浓度[22]。进一步研究发现，由于2型糖尿病患者m6A去甲基化酶FTO的表达增加，导致m6A水平降低，从而进一步增加了患者心脑血管疾病风险[23]。此外，Yang等[24]研究发现2型糖尿病患者METTL3和METTL14水平升高。同时高糖刺激FTO表达增加，从而诱导叉头转录因子、葡萄糖-6-磷酸酶及二酯酰甘油转移酶2表达增加，这与2型糖尿病的发生发展关系密切。故推测在2型糖尿病患者中，血糖升高可刺激FTO表达增加，导致m6A水平降低，从而使甲基转移酶METTL3和METTL14继发性表达增加。

2.3 高脂血症 研究表明m6A修饰在脂质代谢中发挥重要作用[25-28]。肝脏YTH结构域包含蛋白2（YT521-B homology domain containing 2，YTHDC2）通过识别m6A位点，抑制肝脏脂肪基因mRNA的稳定性，从而阻止其翻译和表达[25]。抑制YTHDC2表达可导致小鼠肝脏中三酰甘油的积累。此外，当敲除m6A甲基转移酶Mettl3时，可使过氧化物酶体增殖物激活受体α mRNA稳定性增强，从而提高其表达水平，减少脂质积累[26]。

另外，研究发现METTL3通过脂肪酸合酶mRNA的m6A甲基化抑制肝脏对胰岛素的敏感性，从而促进脂肪酸合成[27]。研究发现已有大量脂质相关的m6A-SNP，并表明m6A-SNP可能发挥调控脂质代谢的作用[28]。

2.4 肥胖 研究表明，m6A修饰与肥胖的发生发展关系密切[25，29-32]。Wang等[29]发现m6A去甲基化酶FTO通过靶向自噬相关蛋白5和自噬相关蛋白7调节自噬体和脂肪的形成；敲除小鼠Fto，可减少白色脂肪生成，并在体内抑制靶向自噬相关蛋白5和自噬相关蛋白7依赖的自噬。在高脂饮食造成的小鼠肥胖模型中，发现m6A水平升高，肝脏中METTL3蛋白水平增加，FTO表达下降，故推测METTL3上调和FTO下调可能是导致肥胖患者m6A水平升高的原因[25]。此外，FTO通过抑制猪肌内前体脂肪细胞中的Wnt/β-catenin信号转导通路促进前体脂肪细胞的分化，从而促进脂肪形成。因此，抑制FTO的表达可抑制前体脂肪细胞的增殖和分化，从而抑制脂肪形成[30]。FTO也可通过调节有丝分裂促进脂肪细胞的增殖[31]。研究发现m6A甲基化转移酶复合体中WTAP、METTL3、METTL14通过促进有丝分裂扩增过程的细胞周期转变而促进脂肪细胞的分化和增殖，也可促进脂肪形成[32]。该结果推测可能因为m6A甲基转移酶复合体和FTO调控的基因不同。

3 m6A修饰在心血管疾病中的作用

研究表明，心肌缺血后m6A修饰增加[2，33]。由于METTL3表达明显上调，m6A甲基化水平升高，从而抑制缺氧-复氧处理的心肌细胞自噬，促进细胞凋亡。敲除Mettl3可降低经过缺氧-复氧处理的心肌细胞或缺血-再灌注处理的小鼠心脏组织中m6A水平，诱导自噬的增强，并减少细胞的凋亡[33]。

m6A去甲基化酶A L K BH 5过表达也可以减轻M ET TL3对缺氧-复氧处理的心肌细胞的影响，减少细胞凋亡。转录因子EB（transcription factor EB，TFEB）是METTL3作用的下游元件，METTL3可通过甲基化TFEB促进RNA结合蛋白异构核糖核蛋白D（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D，HNRNPD）与TFEB mRNA前体的结合，降低TFEB的表达水平，同时也可以相反地影响ALKBH5和METTL3，即与ALKBH5启动子结合并激活其转录，减少细胞凋亡。还可通过下调mRNA的稳定性抑制METTL3，从而增强心肌细胞自噬，抑制细胞凋亡[33]。

4 m6A修饰在脑血管疾病中的作用

研究表明，在脑血管疾病中m6A甲基化水平升高[34]。与未缺血组相比，小鼠大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）1 h再灌注后3 h、6 h，FTO mRNA水平均降低；再灌注后12 h，FTO mRNA及其蛋白水平均降低，总去甲基化酶活性降低，使雄性小鼠总体m6A水平升高；再灌注后24 h，雌性小鼠总体m6A水平也升高，而且m6A结合蛋白YTHDF1、YTHDF3 mRNA表达水平升高[34]。整体过程中m6A甲基转移酶表达并无明显改变，但总去甲基化酶活性却降低[34]。其中神经元中FTO的mRNA及蛋白表达均下调，ALKBH5表达未发生改变，可推测脑缺血后由于FTO下调，使m6A去甲基化减少，造成m6A水平升高。由于FTO是一种氧依赖性酶，故脑缺血后细胞缺血缺氧使FTO表达及活性下降，m6A水平升高，可能是引起继发性脑损伤的原因之一[35-36]。

此外，Xu等[37]研究还发现MCAO发生后ALKBH5蛋白水平也显著增加，但因总m6A甲基化水平升高，可推测ALKBH5蛋白水平的增加是继发性改变。研究发现，在氧葡萄糖剥夺/复氧治疗后，敲除Alkbh5可加重缺氧造成的脑损伤，而FTO过表达可减轻氧葡萄糖剥夺/复氧引起的损伤[37]。进一步研究发现这是由于敲除Alkbh5，使凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl2）基因转录本m6A甲基化提高，Bcl2 mRNA降解，降低了Bcl2的表达，从而促进细胞凋亡。而FTO的过表达增加了Bcl2 mRNA及蛋白水平，并减轻了缺氧引起的细胞凋亡。

细胞焦亡是一种细胞程序性死亡方式，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物释放，进而激活强烈的炎症反应[38]。脑缺血/再灌注损伤常常会导致神经元的不可逆损伤，常表现为细胞焦亡。研究表明低温治疗可以减轻缺血再灌注造成的细胞焦亡[39]。Diao等[39]发现低温可以通过抑制抑癌基因磷酸酶与张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homologous protein，PTEN）的m6A甲基化，从而激活磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B信号转导通路磷酸化，保护神经元免受缺血缺氧引起的细胞焦亡。在缺氧/复氧的神经元中，细胞活性下降，总RNA和PTEN mRNA的甲基化及表达水平升高，而低温治疗可保留细胞活力，使PTEN mRNA甲基化及表达水平降低，从而激活磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B信号转导通路，抑制细胞焦亡[39]。研究发现MicroRNA-421-3p作用于m6A读码蛋白YTHDF1，使其抑制炎症信号通路核因子κB中p65 mRNA翻译，从而抑制脑缺血/再灌注损伤中的炎症反应[40]。

目前，m6A的动态调控与心脑血管疾病的关系已经成为心脑血管领域的研究热点。m6A调控心脑血管疾病的发生发展机制大多从调控甲基转移酶与去甲基化酶的平衡方面推测获得，但具体机制尚未明确。此外，由于当前技术的限制，对单独mRNA m6A位点的改变仍有一定难度。综上所述，对m6A动态且可逆的进行调控，从而影响心脑血管疾病的发生发展，可为心脑血管疾病的预防和治疗提供新的靶点和思路。

【点睛】本文综述了m6A修饰及相关调控蛋白在心脑血管疾病发生发展中的作用，为心脑血管疾病的预防和治疗提供新的思路。