间充质干细胞移植治疗股骨头坏死的研究进展*

刘沛 刘国杰 叶晔 李帅垒 孙永强 郭万首 王卫国 张启栋**

（1.河南省洛阳正骨医院河南省骨科医院人工关节翻修科，郑州 450000；2.中日友好医院骨科，北京 100029）

股骨头坏死（osteonecrosis of femoral head,ONFH）好发于20～50 岁的中青年，若早期失治误治，大约70%的患者2 年内将发生股骨头塌陷。ONFH的治疗方法可归纳为3类：①手术治疗；②手术保髋治疗；③全髋关节置换术（total hip arthroplasty,THA）。非手术治疗的疗效欠佳，往往最终仍需手术治疗[1]。手术保髋治疗的术式包括：单通道或多通道髓芯减压术（core decompression,CD）[2]、各类截骨术[3,4]、带血管蒂或不带血管蒂的植骨术[5,6]，这些手术方法各有利弊。对于晚期的ONFH，THA 是最终和最佳的治疗选择。但是，年轻、活动量大的患者初次THA术后将面临二次或多次翻修的风险；患者的生活、工作、运动方式存在不同程度受限，松动、感染、脱位等与假体相关的并发症的发生率也相对较高[7]。

间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是一种具有自我增殖、分化潜能的细胞群体，在机体发育、疾病发展及治疗中发挥着重要的作用。1993 年，Hernigou 等首次应用自体骨髓间充质干细胞（bone marrow stem cells,BMSCs）治疗ONFH，并于2002 年报道了该技术的保髋成功率高达93.8%[8]。越来越多成功病例的报道，让MSCs治疗ONFH成为研究的热点。本文就该技术治疗ONFH 的基础研究和临床应用进行综述。

1 基础研究

1.1 作用机制

Gangji等[9]发现，骨坏死区干细胞的数量及活性明显下降，并提出将具有成血管和成骨分化潜能的干细胞移植至骨坏死区的治疗思路。因此，干细胞移植治疗ONFH 的关键是：作为“种子”的干细胞能否在坏死区缺血、低氧的微环境下存活并发挥其分化潜能[10]。Yan等[11]对犬的创伤性ONFH模型实施CD 联合自体的MSCs 移植术，研究发现：绿色荧光蛋白标记的MSCs 可以在ONFH 病灶内存活12周；增殖方面，从第2周的15%增殖至第12周的38%；成骨方面，两组在第2周时差异无统计学意义（9.36%vs8.42%，P＞0.05），在第8周、第12周时MSCs 组均优于对照组（22.82%vs14.72%，P＜0.05；31.08%vs20.66%，P＜0.05）。上述结论表明：移植的自体MSCs可以在ONFH缺血的微环境下存活、增殖并分化成骨。Jin 等[12]得到相似的结论：经动脉介入灌注的MSCs 可以迁移到股骨头的坏死灶，并分化为成骨细胞。Ciapetti 等[13]的研究进一步证实：与正常氧分压组（21%PO2）BMSCs分化能力相比，低氧分压组（2%PO2）BMSCs 的增殖能力明显提高，碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、Ⅰ型胶原酶、骨钙蛋白等与成骨分化相关的基因均高表达；而且成骨诱导的矿物沉积不但没有受到抑制，在某些病例反而有增强的趋势。上述研究表明，移植的自体BMSCs可以在骨坏死灶低氧的微环境下生存，并保持其分化潜能。Fan 等[14]研究发现，与正常组兔子BMSCs 的分化功能相比，ONFH 组BMSCs 的成骨分化降低、成脂分化增加；然而，在低氧暴露后，其损伤的增殖潜能得到逆转，表现为成骨分化增加、成脂分化减少。同时，作者还发现：CD 术后，低氧分压组MSCs 的血管生成能力增加，凋亡降低[15]。多项研究也得出类似的结论：分化初始阶段的MSCs 接受低氧暴露，可以促进成骨分化表达[16,17]。

在ONFH的动物模型中，移植的MSCs可以在缺血、低氧的微环境下存活、增殖并分化成骨；低氧的微环境不但没有损伤MSCs 的功能，反而促进其成骨分化。

1.2 MSCs的基因工程

基因工程也可用来修饰干细胞，如骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein-2,BMP-2）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）等。Tang 等[18]采用BMP-2 修饰的BMSCs 来修复山羊模型的ONFH，取得了良好的效果。Pend 和Wang[19]证明BMP-2 和bFGF 成骨、成血管共修饰的BMSCs 可以成功修复比格犬模型的骨坏死。VEGF 单独或联合BMP-2 修饰的MSCs 在犬和兔子的实验模型中也取得了良好的效果[20,21]。Wen 等[22]研究表明，CD 联合HGF 转染的自体BMSCs 移植可以促进兔子ONFH 模型中血管的再生、骨的重建。

MSCs的基因修饰有望成为提高ONFH疗效的一种潜在的有效方法。然而，上述结果都是在动物实验中获得的，其在ONFH 患者中的有效性和安全性仍需进一步评估。

1.3 MSCs来源的外泌体

除增殖、分化潜能外，MSCs还具有旁分泌的功能[23]。一方面，它能够分泌生长因子、细胞因子、趋化因子等多种活性因子，进入骨坏死区，促进成血管、成骨分化。另一方面，它可以通过分泌不同类型的胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）调节靶基因功能，比如外泌体、微囊泡。外泌体富含mRNA、miRNA、酶、脂质等多种成分，具有调节局部微环境，抑制炎症反应，促进损伤组织修复等功能。与MSCs 相比，外泌体具有以下优势：①明显免疫原性[24]；②直径为40～160 nm，降低了血管栓塞、致瘤等风险；③稳定性好，-20℃环境下可离体保存6 个月；④使用方便，可采用口服或静脉注射等方式使用，避免手术或介入操作所致的并发症。因此，理论上分析，MSCs 来源外泌体（exosomes derived from MSCs,MSCs-Exos）移植治疗ONFH 更具发展前景。

Guo等[25]将人滑膜MSCs-Exos经尾静脉注射至大鼠激素性ONFH 模型中，发现其具有改善糖皮质激素对BMSCs增殖抑制和促进凋亡的效应。Liu等[26]发现诱导性多能MSCs-Exos 通过激活PI3K/Akt 信号通路，从而促进大鼠激素性ONFH 模型的股骨头血管生成，延缓骨坏死的进展。周山健等[27]制备了富含miR-126的BMSCs-Exos，发现其能够改善大鼠激素性ONFH的血供，增加骨量。Liao等[28]发现携带过表达miR-122-5p 的BMSCs-Exos 经MAPK 信号通路下调SPRY2，从而延缓ONFH 的进展。Fang 等[29]发现大鼠的BMSCs-Exos 成脂分化受到抑制，差异表达的基因表现为成骨分化相关的BMP2、BMP6、BMP1b、MMP9、SOX9 上调，信号通路涉及免疫反应、成骨分化和转化生长因子β/BMP。

MSCs-Exos 虽在ONFH 的动物实验中取得了良好的疗效，但其作用机制仍不明确，MSCs-Exos 能否取代MSCs 还有待进一步研究。此外，有报道称外泌体载体可以转移与神经退行性疾病相关的毒性蛋白[30]。因此，MSCs-Exos的安全性问题不容忽视。

2 临床应用

2.1 临床疗效

近年来，关于MSCs移植治疗ONFH的临床报道越来越多。有些学者认为：该方法能够有效缓解疼痛，改善关节活动度和功能，延缓骨坏死病程的进展，甚至避免THA。Kang 等[31]一项纳入了106 髋的研究发现，MSCs 治疗组因保髋失败而改行THA 的比例低于对照组（20%vs50%，P=0.014）。然而，一些学者对此技术持谨慎态度。Pepke等[32]一项纳入了25髋的前瞻性随机对照试验显示：经过2年的随访，与CD 组相比，CD 联合骨髓抽取物组并没有显著提高保髋的成功率。Papakostidis 等[33]meta 分析认为，在股骨头塌陷前，将自体BMSCs 经CD 通道移植，可以提高股骨头的存活率，减少THA 的需求率。同时，Mao 等[34]一项纳入了13 篇随机对照试验的meta分析也得到相似的结论：干细胞移植疗法可以有效预防早期ONFH的进展。

因此，尽管存在一些争议，MSCs 移植治疗ONFH 能够促进坏死区骨组织的修复、减轻髋关节疼痛、延缓病情进展已得到大部分学者的认可。临床疗效不同的原因可能在于研究间的异质性，如患者选择、细胞来源、细胞移植数量和细胞移植方式等差异。

2.2 患者选择

研究表明，MSCs移植治疗ONFH的临床疗效与患者自身因素具有相关性。ONFH 的分期是最重要的影响因素之一。Ma等[35]一项纳入了53髋的前瞻性随机双盲对照试验表明：CD 联合MSCs 技术对于Ficat Ⅰ、Ⅱ期的ONFH 治愈率高达100%。同时，Kang 等[31]报道：CD 联合BMSCs 不能延缓ARCO Ⅲ、Ⅳ期骨坏死的进程。Sen等[36]认为，创伤性ONFH的预后优于非创伤性ONFH，这表明病因是影响临床疗效的另一个因素。此外，Houdek 等[37]认为改良Kerboul 角较小的患者能获得更好的疗效。因此，ONFH 分期、坏死灶大小、部位以及病因等都是影响疗效的重要因素。随着年龄增长，供区提取、分离的MSCs 数量随之减少，增殖能力也有所降低[38]。Stenderup等[39]进一步研究发现：老年人的MSCs功能在体外试验中是降低的，但并不影响其在体内的分化能力。Ganguly等[40]通过成纤维集落分析和流式细胞术检测发现，BMSCs 数量、功能与年龄无相关性。Sen等[36]报道，患者的性别、病变关节的侧别以及对侧髋关节是否受累均不影响BMSCs的功能。上述因素是否影响ONFH的保髋疗效尚存争议。

因此，MSCs移植保髋治疗获得满意疗效的前提是选择适当的患者。

2.3 MSCs与其他来源干细胞的对比

可用于ONFH 治疗的干细胞包括：MSCs、脂肪干细胞（adipose derived stem cell,ADSCs）、脐血干细胞（cord blood stem cell,CBSCs）和外周血干细胞（peripheral blood stem cell,PBSCs）。BMSCs是最为常用的MSCs，Rastogi 等[41]对比了CD 联合离心的单个核细胞组和CD 联合未处理的骨髓抽取物组之间的疗效，研究结果发现：两组的髋关节功能评分较术前均有显著改善；MRI 复查发现，离心的单个核细胞组骨坏死病灶面积减小，而骨髓抽取物组10%的病例需行THA。作者认为，对于早期ONFH 的治疗，离心的单个核细胞组疗效更优。此外，ADSCs也是常用的“种子”细胞。与BMSCs 相比，ADSCs具有来源广泛、获取量大、成本低、创伤小、痛苦少等优势。体外研究还表明，在细胞生长速度、成骨分化方面，ADSCs 优于BMSCs[42]。Pak[43]发现自体ADSCs 联合富血小板血浆（platelet rich plasma,PRP）髋关节局部注射后，病变关节疼痛缓解，功能改善，MRI 复查发现新骨形成。CBSCs 来源于废弃的脐带，来源广泛，收集简单，伦理可行；而且易于分离，数量大，免疫原性低，可传30～40 代，体外扩增简便。Cai等[44]观察了自体BMSCs和异体脐血干细胞（human umbilical cord-derived MSCs,hUC MSCs）移植治疗ONFH的疗效，随访12个月未发现严重不良反应。Chen 等[45]分析了hUC MSCs 移植治疗ONFH 的临床效果，经过3 年的随访发现，坏死灶减少，且无明显副作用。

然而，上述研究的病例数量均较少，仍需大样本量高质量随机对照试验的长期随访来评估不同组织来源干细胞移植治疗ONFH的有效性和安全性。

2.4 移植MSCs的数量

文献报道，MSCs移植治疗ONFH的疗效与细胞数量具有相关性[33,37]。髂骨骨髓中约每3万个有核细胞中含1 个祖细胞，骨髓有核细胞平均数为18×106/ml，因此祖细胞的数量约为600/ml。通过MRI 和组织学观察显示，股骨头中骨小梁的比例约为1/3，其余2/3 为脂肪和血液细胞[46]。根据松质骨的1/3 为骨基质估算，每立方厘米新骨约含有2000万个成骨细胞或骨细胞[46]。因坏死灶的平均体积约为15 cm3，所以大约需要3×108个（2000 万个细胞/cm3×15 cm3）成骨细胞或骨细胞来进行新骨的修复。早期，Hernigou等[47]报道的BMSCs注射剂量为24×103至25×103个细胞。目前，大部分文献报道的剂量为106～109，其中最常用的剂量为108[32,36,41,48,49]。

然而，成骨细胞和骨细胞数量不仅取决于所注射的干细胞的数量，还与在骨坏死缺血、低氧的微环境下，干细胞可增殖的次数、具有成骨分化活性干细胞的数量相关。此外，是否注射的干细胞数量越多越好，以及是否存在最大注射量的安全阈值，仍然未知。

2.5 MSCs的移植方式

MSCs 移植治疗ONFH 的移植方式主要有3 种：①动脉介入法。利用动脉介入技术，将MSCs 注入旋股内侧动脉、旋股外侧动脉或闭孔动脉，利用血液循环携带干细胞至股骨头的坏死灶处。Cai等[44]通过数字减影血管造影术将自体BMSCs 和异体CBSCs移植至股骨头动脉，发现该方法可以提高保髋成功率。该研究表明，经动脉介入干细胞灌注法是治疗ONFH 的有效方法，但需要相应的设备和一定的介入操作技术。②髓芯减压通道灌注法。利用CD 的骨道，将干细胞混悬液注入股骨头的坏死灶局部[32,50]。该方法克服了干细胞混悬液因血液再分配所致数量不足的弊端，增加“种子细胞”的密度。因此，经CD 通道干细胞原位灌注法可以显著提高疗效[51]。③复合支架材料植入法。该方法将经体外分离、鉴定、纯化的干细胞，在标准化制备后通过支架载体植入骨坏死灶。Kang 等[52]采用自体髂骨联合BMSCs 移植治疗ONFH 患者52 例（61 髋），经平均68 个月的随访，对早期ONFH 保髋疗效显著。Kawate 等[53]以β-磷酸三钙为载体复合自体BMSCs，联合游离腓骨移植治疗ONFH，影像学随访检查发现新骨形成。该方法的优势在于不仅保证了干细胞的质量，而且可以使移植细胞的数量精准化。但耗时长、成本高，有可能损伤干细胞的分化潜能，从而影响疗效。

总体来说，无论使用哪种MSCs 移植方式，均能取得良好的临床疗效。

2.6 MSCs移植的安全性

干细胞移植可增加异位骨化[54]、致癌的风险[55]，免疫排斥和细胞去分化等问题也限制了干细胞移植技术的临床应用[56]。回顾目前关于MSCs移植治疗ONFH 的文献，大多数研究都未发生严重的并发症，只有少数研究报道患者出现脸红、轻度头痛和发热等并发症[57]。此外，对于需要在体外进行扩增的干细胞，整个制备过程必须严格监督、标准化操作，既要保持干细胞整体表型和分化潜能，又要确保所培养的干细胞未被污染。

因此，应用MSCs移植治疗ONFH似乎是相对安全的。然而，仍需更多高质量的研究和长期的随访来证实。

3 总结与展望

综上所述，MSCs移植治疗ONFH是安全、有效的。在基础研究方面，对MSCs进行预处理和精准的细胞亚群选择有望提高ONFH 疗效。同时，利用基因组织工程修饰MSCs也是提高疗效的有益尝试。近年来，MSCs-Exos 在组织再生工程中发挥着越来越重要的作用，并有可能成为MSCs 之外的另一种选择。然而，上述动物实验的结果还有待临床进一步验证。在临床应用方面，早期的ONFH（ARCO Ⅰ、Ⅱ期）、改良Kerboul 角较小的患者似乎是该技术的良好适应证。BMSCs 是最常用的干细胞，其他类型的干细胞，如ADMSCs，生长速度快、成骨分化潜力大，有望成为BMSCs的替代。此外，疗效与MSCs移植的数量相关，根据现有的临床经验，注射106～109个有核细胞可能是比较合适的，但目前仍无注射数量、频次及移植方法的参考标准。