热消融的抗肿瘤免疫效应及其应用的研究进展

蒋雨轩， 严羽欣， 刘文哲， 李雪， 夏添松

热消融治疗方法是利用不同的能量快速加热靶病灶，使用物理热能造成细胞及组织的凝固性坏死，从而灭活靶病灶。根据热能来源的差异，可分为高强度超声(high intensity focused ultrasound,HIFU)、微波消融(microwave ablation,MWA)、射频消融(radiofrequency ablation，RFA)等。因其具有非侵入性、精准等优点，近年来得到快速发展，在子宫肌瘤、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、骨肉瘤等治疗中取得较大进展。热消融技术不但能够原位灭活肿瘤细胞，还能增强机体的抗肿瘤免疫[1]。热消融治疗后，肿瘤抗原的释放等途径有可能诱导肿瘤相关的免疫反应，有助于肿瘤的治疗。

1 肿瘤的免疫逃逸机制

肿瘤的发生、发展和转移等过程与机体免疫监视能力关系紧密，T淋巴细胞和自然杀伤细胞(natural killer cell， NK)在机体抗肿瘤的免疫监视功能中发挥着重要作用。在肿瘤发生发展的过程中，肿瘤细胞可以通过阻碍抗原呈递细胞(antigen-presenting cells, APC)的激活、产生免疫抑制细胞因子和抑制性细胞等不同方法抵抗人体免疫系统的监视和清除，即免疫逃逸。相关研究发现，当肿瘤免疫逃逸发生时，淋巴细胞发生了显著的变化：NK细胞显著减少，调节性T细胞(regulatory cells, Treg)增加，这可能是由于肿瘤细胞主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex， MHC)Ⅰ、Ⅱ类分子共刺激信号的缺乏或异常表达等原因导致的[2]。此外，肿瘤细胞的免疫逃逸也与某些细胞因子水平的变化密切相关。癌症患者机体中，白细胞介素-8(Interleukin 8, IL-8)等免疫因子水平升高，抑制了CD8+T细胞的活性[3]；IL-4、IL-10大量产生，使γ-干扰素(Interferon γ， IFN-γ)水平降低，且Th1/Th2降低，肿瘤细胞通过抑制CD4+T细胞向Th1细胞的分化来实现免疫抑制[4]。

2 热消融的免疫调节机制

癌细胞的死亡及后续反应启动了免疫原性级联反应。热消融后机体抗肿瘤免疫的建立和增强取决于肿瘤细胞死亡产生的抗原和分泌性物质。前者指癌细胞被杀死时释放或暴露抗原，激活T淋巴细胞产生免疫反应；后者指坏死细胞和周围组织释放热休克蛋白(heat shock proteins,HSP)等或损伤相关分子模式或多种细胞因子，增强机体抗肿瘤免疫。下面对于热消融的免疫调节机制做简要综述，特别考虑了不同热消融治疗方式产生的不同效应。

2.1 肿瘤抗原的释放与抗原性改变 肿瘤抗原可诱导宿主免疫应答。热消融治疗中，高温导致细胞凝固性坏死，破坏细胞结构，使肿瘤细胞释放多种抗原性物质[5]。这个过程中，高温是较主要的因素。但HIFU的其他非热学机制也发挥作用，如瞬间空化效应，能产生气泡，使肿瘤细胞的细胞膜、核膜、线粒体和内质网等在短时间内膨胀收缩。这些膜性结构被机械破坏，直至破裂成碎片状，导致肿瘤抗原更彻底释放，增强机体抗肿瘤免疫反应[6]。

肿瘤抗原大量释放后，可以被树突状细胞(dendritic cells,DC)捕获和处理，随后DC将捕获的肿瘤抗原呈递给未致敏T细胞，启动、激活针对肿瘤抗原的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte， CTL)。CTL可以识别MHC-I类分子呈递的肿瘤抗原，进一步破坏靶癌细胞，扩大癌症的免疫周期[7]，增强机体的抗肿瘤免疫反应能力。丁振昊等[8]发现，在肝癌患者接受RFA治疗后，体液中的IgA、IgG及IgM浓度明显上升，提示抗肿瘤免疫及全身免疫功能得到明显提高。

热消融产生的热量使细胞膜流动性增强，暴露肿瘤细胞抗原决定簇或改变其空间结构，提高其抗原性，促进抗体结合抗原，进而促进APC对抗原的捕获与呈递，刺激机体产生免疫应答，杀伤同源性肿瘤细胞。研究表明，热消融还可以提高淋巴细胞的免疫能力。RFA治疗后，CD3+、CD4+水平明显上升，抑制性CD8+T淋巴细胞水平下降，CD4+/CD8+比值显著升高[9]。CD4+T细胞主要通过其释放的细胞因子激活单核细胞、巨噬细胞和NK细胞，再由单核细胞、巨噬细胞和NK细胞介导，发挥杀伤肿瘤细胞的作用。

热消融后，一些肿瘤抗原仍保留在肿瘤碎片中，可能是刺激免疫系统的潜在抗原来源。更多特异性抗原，如HSP-肽复合物，在热消融治疗后能否继续诱导宿主抗肿瘤免疫方面是未来研究的要点。

2.2 热休克蛋白 高温诱导下，细胞产生HSP。HSP属于应激反应性蛋白，是分子伴侣的一种，在蛋白质修饰过程中，能够促进多肽链折叠为有天然空间构象的蛋白质，具有广泛的生理作用。

热消融治疗后局部HSP表达上调，帮助体内抗原的呈递，增强肿瘤细胞的免疫原性，产生强大的细胞免疫应答。HSP的表达与肿瘤免疫原性强弱密切相关[10]。Kramer等[11]使用HIFU治疗前列腺癌患者，发现HSP在热消融导致的肿瘤凝固区高表达，且表达时间变长。

作为HSP家族非常重要的一员，HSP70能够结合肿瘤肽抗原，与多肽结合形成HSP-肽复合物，增强肿瘤细胞的免疫原性，承担抗原肽载体的作用。HSP协助抗原提呈至APC，诱导APC分泌细胞因子及趋化因子，进而加强CTL、NK细胞和淋巴细胞因子等对肿瘤细胞的杀伤能力。

罗善明等[12]发现，HSP70-肽复合物可以刺激DC成熟，促进DC分泌各种细胞因子，诱导特异性抗肿瘤细胞免疫。此外，HSP70-肽复合物能够显著提高DC的肿瘤抗原提呈能力，提高肝癌细胞抗原的免疫原性，激活未致敏T细胞，诱导较强的特异性抗肿瘤免疫。有研究模拟了HSP的结构，开发新型纳米疫苗[13]，发现其可与DC细胞相互作用，增强抗原在细胞质中的交叉呈递，增强抗肿瘤免疫反应。

另外，HSP还可能与一种执行固有免疫功能的T细胞即γδT细胞的活化有关[14]。细胞应激后可以表达HSP70等分子，γδT细胞识别这些分子并被激活，表达出对应激细胞的细胞毒活性。

但是，非致死热处理会使肿瘤细胞发生上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition， EMT)，促进肿瘤转移，这一变化很可能与HSP有关[15]。研究显示，不完全的肝癌RFA增加了消融灶组织内的HSP70，可以刺激远处的肿瘤生长。使用HSP抑制剂可以降低全身性致瘤作用[16]。

2.3 细胞因子理论 肿瘤细胞产生IL-10、TGF-β、PGE2等多种免疫抑制因子，抑制DC的活性，降低机体抗肿瘤免疫功能。而细胞因子相关理论认为：一方面热消融产生的高热可以降低或灭活这些免疫抑制因子，解除免疫抑制；一方面受热作用刺激，肿瘤细胞的生物因子受体活性被激发，可以改善全身及肿瘤局部免疫微环境，增强抗肿瘤免疫。

热消融治疗后，肿瘤微环境中TGF-β1水平一般有明显降低,但也有研究表明[17]，单一或不足的热消融治疗后，Treg和CTL明显下调，TGF-β和IL-10表达上调，表明对细胞免疫的轻微抑制可能会影响抗肿瘤免疫。所以在热消融治疗后再采取免疫调节疗法，恢复Th1和Tc主导的免疫反应是必要的。

肿瘤免疫过程中，Th细胞通过分泌细胞因子发挥重要的辅助作用。HIFU治疗后，肿瘤局部环境中T细胞、巨噬细胞明显增加，T细胞、NK细胞浸润增强，外周血中，CD3+/CD4+及CD4+/CD8+明显上升[18]。研究表明，在MWA后，IL-2，IL-1β，IL-6，IL-8和TNF-α较原来增加了两倍[19]。RFA治疗后，血清IL-10水平下降[20]。但有实验表明，NK细胞才是在延长生存期中起重要作用的免疫细胞，MWA通过激活巨噬细胞，产生IL-15以激活自体NK细胞，抑制转移性乳腺癌原发肿瘤的转移进展[21]。

在机体的抗肿瘤免疫中，细胞免疫与体液免疫共同发挥作用。热消融通过提高IL-12等增强机体抗肿瘤免疫因子的浓度，降低免疫抑制因子的浓度，增强抗肿瘤免疫作用。

2.4 异位效应 异位效应指局部的肿瘤热消融治疗引起远距离的肿瘤转移灶消退的现象[22]。热消融后，患者的抗肿瘤免疫反应增强，杀灭转移的肿瘤细胞。相较于传统手术切除治疗的小鼠，经RFA治疗的结肠腺癌小鼠对肿瘤再接种表现出更强的抗肿瘤免疫能力[23]。MWA后，HCC患者的肿瘤特异性T细胞应答(IFN-γ和IL-5)比其他患者更频繁，并表现出更长的无进展生存期[24]。

热消融对肿瘤的破坏诱导了肿瘤抗原的释放，进而激活了免疫系统，引发了人体抗肿瘤免疫系统的反应[25]。HIFU具有热消融产生的异位效应，与其他热消融技术的重要区别是，HIFU通过空化和机械效应彻底破坏肿瘤细胞结构，更彻底地暴露释放肿瘤抗原，引发全身性抗肿瘤免疫。

热消融局部治疗使组织释放促炎性细胞因子，特别是IL-1和IL-8。IL-1和IL-8可以促进Th1反应，促进DC和CTL的活化，从而杀死肿瘤细胞,P53和转化生长因子的参与也起相同的作用[26]。

异位效应的机制尚未研究完全。热消融导致异位效应属于罕见事件，不足的MWA甚至会通过激活β-catenin信号通路来促进残留乳腺癌的EMT，导致残留乳腺癌转移增强[27]。但热消融治疗与免疫治疗联合可以引发有效的异位效应：热消融结合Toll样受体激动剂治疗后[28]，90%的远处肿瘤有反应，CD11c+和CD3的表达增强，增加了远处肿瘤中独特的T细胞受体重排的数量。HIFU和检查点抑制剂联合治疗已建立双侧肿瘤的小鼠时，相较于单独使用HIFU或检查点抑制剂治疗，更明显的诱导了CD4+、CD8α+、CD11c+等，具有明显的异位作用[29]。

3 热消融联合免疫疗法在肿瘤治疗中的应用

单独的热消融刺激的确能激发免疫系统功能，但激发的总体抗肿瘤效应较弱。且热消融治疗也可能抑制免疫系统功能，增强肿瘤的生长和扩散，不利于肿瘤的治疗[30]。因此，使用适当的免疫疗法联合热消融，可以增强热消融诱导产生的免疫作用，使全身性的抗肿瘤免疫更加有效，更好地抑制肿瘤的复发转移。

聚焦超声联合微泡搭载免疫药物治疗可以增强机体的抗肿瘤免疫。微泡的破坏增强了细胞膜的通透性，使免疫药物能够跨越屏障，富集于肿瘤内，更好地刺激机体抗肿瘤免疫。Narihira等[31]在口腔部鳞状细胞癌的实验中发现，微泡搭载西妥昔单抗对口腔部鳞状细胞癌的抑制作用较单独给药增加了5倍。

阻止检查点介导的抑制T细胞反应的抗体在肿瘤治疗领域的作用日益突出。抗PD-1抗体(anti-PD-1 antibody， aPD-1)是重要的检查点抑制剂，可阻断PD-1与其CTL上的配体结合，促进免疫检查点抗体向残留的肿瘤的传递，解除免疫耐受，降低肿瘤复发率。Bulner等[32]发现与单一治疗相比，aPD-1与超声微泡的结合显示出抑制肿瘤和延长动物生存时间的潜力。针对程序性死亡配体1(Programmed Death-Ligand 1, PD-L1)工程化的血小板的单克隆抗体可通过促进aPD-1转运至高强度聚焦超声消融区域，有效抑制肿瘤局部复发[33]。MWA联合免疫检查点封锁治疗乳腺癌诱导血浆IFN-γ升高，同时增强特异性免疫反应，帮助小鼠抵抗4T1肿瘤再攻击[34]。HIFU与αCTLA-4和αPD-L1的组合可显著增强抗肿瘤反应，诱导肿瘤内CD4、CD8、CD11c T细胞明显增加，循环中的IL10降低[35]。

免疫激动剂可增强热消融诱导的CTL反应，从而有效抑制原发性肿瘤的生长和肺转移。RFA与免疫刺激剂OK-432联用，可以增加OX-62+相对特异性抗原、CD4+、CD8+、DC，IFN-γ和TNF-α细胞的数量，介导肿瘤抑制[36]。MWA与OK-432联用，可以增加CD4+和CD8+T细胞肿瘤浸润，并使Th1/Th2升高，极化T细胞对Th1优势状态的反应[37]。

热消融治疗与化疗药物的联用也可以增强机体抗肿瘤免疫。HIFU和吉西他滨的联合使用抑制了原发性三阴性乳腺癌的生长，延长了小鼠的总体生存期[38]。

4 总结和展望

热消融疗法已成为临床上微创治疗肿瘤的有效方式，并逐渐被人们接受。大量的研究提示，热消融能增强患者的抗肿瘤免疫能力，有助于降低肿瘤的复发与转移风险。单一热消融治疗也有可能导致短期的机体抗肿瘤免疫强度降低，明确热消融适应证，联合适当的免疫辅助治疗是必要的。针对不同热消融的非热学机制所导致的机体抗肿瘤免疫机制的研究较为有限，还需要进一步深入。

热消融介导患者抗肿瘤免疫能力增强的主要可能机制有：①热消融导致肿瘤细胞凝固性坏死，释放多种抗原性物质，诱导机体特异性免疫的产生。②热效应使局部HSP表达上调，活化γδT细胞，激活CTL，增强肿瘤细胞的免疫原性。③热消融治疗可以改善肿瘤局部及全身免疫微环境。热消融治疗诱导全身抗肿瘤免疫，起到灭活原位肿瘤和肿瘤转移灶的作用。

热消融在肿瘤临床的应用前景广泛。更好地理解热消融技术与具体肿瘤及分型的作用模式，将热消融与免疫疗法相结合，规范临床应用，在提高肿瘤疗效、改善患者生活质量、减少复发转移等方面具有很大潜力。