体外HPV感染皮肤粘膜细胞及器官模型的研究进展

唐奕, 陈荃, 彭丽倩, 陈教全, 李华平, 朱慧兰

1.广州医科大学，广东 广州 511436;2.广州市皮肤病防治所，广东 广州 510095

人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一种双链闭环的小型无包膜DNA病毒，包括两百多种不同的分型，具有严格的种属和组织特异性。HPV基因组全长约7.9 kb，其早期基因编码区具有6个开放阅读框，其中 E1和E2可调节病毒的复制和早期蛋白质的转录，E5-E7可诱导肿瘤发生以及调节后期角质形成细胞的分化和免疫逃逸。E6、E7蛋白介导抑癌蛋白p53和pRb的降解，增加致癌基因蛋白间质表皮转化因子(cellular mesenchymal-epithelial transition factor, c-Met)的表达[1]，从而促进细胞的增殖和扩散，是重要的致癌蛋白[2]。HPV基因组的晚期基因编码区包含两个部分：L1和L2，L1编码主要病毒衣壳蛋白L1蛋白，是HPV疫苗的靶抗原，而L2编码次要病毒衣壳蛋白L2蛋白[2-3]。根据L1、E6、E7基因间核苷酸序列的同源性差异分为5个属，其中α、β属HPV感染最为常见。根据HPV感染部位的不同分为黏膜型、皮肤型，黏膜型HPV多属于α属，皮肤型HPV多属于β属。根据致癌性分为高危型、低危型，高危型如HPV16、HPV18可导致大多数宫颈、阴茎、会阴部及口咽部癌和癌前病变[4]；β属如HPV5、HPV8与疣状表皮发育不良患者继发鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma, SCC)、基底细胞癌(basal cell carcinoma, BCC)的发生有关，且在紫外线照射共同作用下可使光线性角化病发病(actinic keratosis, AK)的风险增加13倍，与皮肤角质形成细胞肿瘤发生相关[5]；低危型如HPV6、HPV11可导致尖锐湿疣等[6]。

早期HPV相关细胞系主要是宫颈癌等肿瘤细胞系，HeLa细胞系是人类最早的体外培养成功的肿瘤细胞系，整合了HPV18型的相关基因，P53表达水平较低，目前应用较多的还有HPV16型阳性的SiHa、含有HPV16型病毒基因组及HPV18型相关基因的CaSki等细胞系。HPV阳性的肿瘤细胞系易于培养，成本较低，为研究HPV感染相关肿瘤中的细胞生物学如肿瘤细胞周期、基因表达和治疗药物靶标等提供了大量的研究材料。肿瘤细胞系中高危型HPV的E6和/或E7基因已整合到人染色体并持续高表达，无法模拟HPV感染中病毒和宿主的相互作用和HPV感染生命周期中病毒基因组的突变，并且有研究指出肿瘤细胞系在培养中存在显著基因组的变异和潜在功能的差异，导致实验出现不可重复的情况[7]。为研究HPV感染的致病机制、临床表现等，国内外学者建立了体外HPV感染模型，对HPV感染的治疗药物及疫苗等研究具有重要的意义。本文对目前体外HPV感染皮肤粘膜细胞及器官模型加以综述。

1 皮肤黏膜细胞模型

HPV的生命周期与受感染上皮细胞的分化密切相关。正常状态下，基底层细胞分裂、分化成熟为角质层细胞时，细胞周期停止，进入不可逆的分化过程。为了达到持续性感染和异常增殖，HPV从基底层进入细胞，随着被感染的上皮细胞向角质层移动，E6和E7被激活，导致正常细胞周期抑制，并影响多种细胞信号通路[8]。含有HPV的基底层细胞移行时，上层细胞持续分裂，HPV晚期启动子被激活，病毒DNA复制出现高拷贝量扩增，表达晚期L1和L2衣壳蛋白。病毒组装完成后，细胞释放出成熟的病毒颗粒，引起持续感染[9]。HPV皮肤黏膜细胞模型为研究HPV感染提供了合适的培养模型，使用最广泛的是原代人包皮角质形成细胞(human foreskin keratinocytes,HFK)、正常永生化角质形成细胞(normal immortalized keratinocytes,NIKS)和转化的人永生化角质形成细胞(human immortalized keratinocytes,HaCaT)。然而，过往的研究结果显示，不同的细胞模型在模拟HPV感染中病毒与宿主相互作用的过程中，会产生不同的影响。HaCaT是目前应用最广泛的细胞，与HFK和NIKS相比更易扩增培养，HPV的感染性更高，对于转染等操作具有更高的耐受性，且经济成本更低[10]。应用HaCaT建立高危型如HPV16、HPV18的细胞模型已多有研究报道，由于低危型HPV的E6、E7基因缺乏转化活性和永生化能力，病毒基因在细胞模型中的稳定性较低，这也是导致低危型HPV体外模型难以研究的瓶颈问题。Wang等[11]采用了脂质体介导的转染法导入HPV11全基因组，构建重组细胞，以及HPV11 DNA和质粒载体pTK-neo共转染方式，构建了含有HPV11基因组的HaCaT重组细胞。HFK的生物学特征最接近于正常人皮肤角质细胞，但是HPV难以感染HFK，在高自噬水平HFK中HPV16的感染力得到了显著增强，与低自噬水平的NIKS和HaCaT呈负相关性；然而，HPV16诱导自噬是宿主的防御机制，高自噬水平抑制了HPV感染，限制了HPV感染效率[12]。另一方面，HFK细胞的存活时间非常短暂，用含有HPV E6、E7基因的逆转录病毒感染HFK细胞，可导致p53和pRb抑癌基因失活，建立永生化的HFK，其分化能力优于HaCaT[13]。NIKS是近二倍体，保留了对接触抑制的正常反应，并且可以支持多种高危HPV类型的生命周期，包括HPV16、HPV18、HPV31、HPV45和HPV58等，多用于HPV感染的器官型培养中。Klymenko等[14]发现HPV感染改变NIKS的近3 000个基因的表达，破坏了NIKS的上皮屏障功能相关的基因表达，例如下调朗格汉斯细胞趋化因子(CC chemokine ligand 20,CCL20)和促炎细胞因子白介素1α的表达，从而认为通过对NIKS基因的操纵分化，促使NIKS提供更利于HPV复制和释放的环境，从而完成HPV的生命周期。永生化角质形成细胞系的优势是，它们提供了相同基因的细胞背景，可在其中比较不同HPV感染类型的或相同HPV类型的突变基因组的表达。虽然可以减少因使用来自不同患病部位的角质形成细胞而产生的批量效应，但由于宿主细胞已经永生，与正常人体细胞的感染仍存在区别，这也是目前模型系统研究中的难点[15]。

可通过多种方法建立模拟HPV感染的细胞模型，主要有基因转染法、实验性感染法等。基因转染法是最为常用的构建途径，可通过电穿孔法、逆转录病毒感染法和脂质体法将目的基因导入受体细胞中。转染后，可以检测细胞中瞬时基因的表达，也可以使用适当的筛选系统筛选稳定携带目的基因的细胞。脂质体与电穿孔两种方法转染SiHa细胞，效率无明显差别，然而脂质体转染后SiHa细胞大部分呈圆形或类圆形改变，电穿孔转染后SiHa细胞形态更多呈现正常形态[16]。质粒载体通常用于将编码shRNA或ORF的质粒递送至HFK和NIKS中，HaCaT转导效率较低[17]。目前转染方法多应用于全基因组转染与基因片段转染两类。Biryukov等[18]培养了HPV16、HPV18共感染模型，模型中产生重复感染排斥效应，HPV18的感染性显著降低，他们认为HPV16阻止或延迟了HPV18的进入或HPV16能够部分阻断HPV18的转录，并提出L2介导了HPV感染的重复感染排斥的观点。

2 器官型培养模型

器官型培养是指在体外环境下，将细胞与具有三维结构的材料共同培养，建立细胞-细胞或细胞-载体复合物，在三维立体的空间中促进细胞迁移、生长、增殖以及信号传导的过程，从而使细胞在体内的生长环境模拟更全面以重现HPV感染的生命周期，器官型培养中的筏式培养是现阶段研究的主要培养方式[19]。为了阐明病毒蛋白在病毒生命周期中的详细作用和分子机制，Asselineau和Prunieras提出器官型筏式培养，使上皮细胞有序的增殖和达到终末的鳞状分化[20]。筏式培养的主要方法是通过成纤维细胞Swiss 3T3 J2或Balb/C 3T3 JCA31与作为饲养细胞的1型大鼠尾胶原混匀培养、产生有孔径的基质样真皮等效物后，将角质形成细胞种植在该真皮等效物表面。首先进行单层培养，24 h左右细胞达到融合，将其在气液界面的金属网格上接种培养，上皮细胞暴露于空气中，通过下层具有稳定性的纤维细胞毛细作用吸取营养，促进角质形成细胞的增殖。培养8～24 d，上皮细胞成长分化为复层鳞状上皮[21]。Bedell等[22]用筏式培养CIN612细胞系，经TPA处理促进突变的终末端分化，产生了子代病毒颗粒。Wang等[23]通过使用Cre-Lox P系统在转染的角质形成细胞中生成大量HPV18病毒颗粒。Cre-Lox P可保留HPV18的超螺旋性，使病毒基因组更接近转录和复制的原始状态，在2周的培养后HPV18在复层上皮中增殖明显并在表层中聚集，并表达大量的L1衣壳蛋白[24]。Cre-Lox P系统为HPV18突变体的研究提供了有效的模型，例如p53被证明是E6蛋白的关键靶点之一，在病毒DNA扩增中受损的HPV18 E6突变体，无法有效破坏p53稳定性，而p53 shRNA可以降低p53蛋白的含量，则使它很大程度恢复[23]。通过Cre-LoxP系统可以在转染细胞中去除质粒并重新环化HPV的附加体，不需要纯化和连接程序。Villa等[25]使用宫颈活检中新鲜切除的宫颈角质形成细胞进行筏式培养，以助于研究与持续性HPV感染相关宫颈癌的分子转化机制。

由于不能在细胞单层培养物中繁殖，因此产生分层和分化上皮的器官型筏式培养已被广泛应用于研究HPV生命周期、感染和传播。研究人员也进一步使用器官型筏式培养来研究HPV与其他上皮性病毒的相互作用，例如单纯疱疹病毒和HPV，腺病毒相关病毒和HPV的相互作用[26]，使用的还有以及多种细胞共培养模型，如肿瘤细胞、免疫细胞等共培养，以明确细胞之间相互作用的影响。器官型筏式培养的主要优点是可以选定病毒基因转导入细胞中建立，合并不同类型的细胞并研究不同组织中细胞相互作用的影响。最近一项研究表明，HPV16的E8^E2C融合蛋白在终末上皮分化的条件下，对病毒的扩增复制过程有调节作用[27]。一些实验室已应用该系统的变体来实现体外生产HPV11和一些主要的高危HPV型病毒粒子，包括HPV16，HPV18和HPV45[28]。

3 结语

HPV体外模型在研究HPV的理化特性、相关疾病的致病机制以及抗HPV感染药物和疫苗中发挥了重要的作用。HPV皮肤黏膜细胞模型是应用最广泛的模型，目前已构建多种HPV亚型的细胞感染模型，但存在因不同细胞系和转染方法导致HPV感染效果不一致、不能模拟HPV感染的完整过程、与人的正常细胞感染仍有区别等局限性；器官型模型是目前模拟HPV生命周期最理想的HPV体外模型，但更合适的细胞系、感染方法和构建器官型模型的方法有待进一步研究。