组蛋白修饰酶抑制剂联合免疫检查点阻断疗法在肿瘤领域的研究进展

张林,丁杰,,李显,樊斐,曾家兴，陈俊豪，黄锐，张媛玲

【提要】 组蛋白修饰在基因调控、肿瘤细胞的增殖和凋亡以及DNA修复等方面发挥了重要作用。近年来，以PD-1、PD-L1及CTLA-4抗体为代表的免疫检查点抑制剂在肿瘤治疗中取得了显著的临床疗效，但临床应用中仍有部分患者无应答。目前众多研究发现，组蛋白修饰中甲基化、乙酰化和泛素化参与了肿瘤微环境中免疫细胞的增殖、分化等过程，并发现一些组蛋白修饰酶抑制剂和免疫检查点阻断疗法之间存在协同效应。本文就组蛋白修饰酶抑制剂联合免疫检查点阻断疗法在肿瘤领域的研究进展进行综述，以期为肿瘤的临床治疗和研究提供新的思路。

表观遗传学的本质是核苷酸序列在没有发生改变的前提下，其功能发生可遗传变化进而导致基因表达水平发生变化[1]。组蛋白修饰作为表观遗传修饰的重要形式之一，对肿瘤的增殖、侵袭和转移起着重要的调控作用，因此逐渐成为肿瘤治疗的潜在靶点。目前，组蛋白修饰酶相关抑制剂已在结肠癌、胃癌等肿瘤研究中取得显著进展[2]，但是大多处于临床前试验阶段，组蛋白修饰对肿瘤调控机制尚未完全阐明，组蛋白修饰酶抑制剂在肿瘤治疗的全面应用仍需更多的研究。

近年来，免疫检查点抑制剂在包括黑色素瘤在内的许多肿瘤治疗中发挥了显著的临床疗效，减少了肿瘤的复发率和转移率[3]，但由于肿瘤的异质性，使用免疫检查点抑制剂时仍有部分患者没有产生有效应答[4]。当前众多研究表明，部分组蛋白甲基化、乙酰化及泛素化修饰酶参与调节包括PD-1、PD-L1及CTLA-4在内的免疫检查点的表达，一些组蛋白修饰酶抑制剂联合免疫检查点阻断疗法产生协同抗肿瘤效应。

1 组蛋白与组蛋白修饰的分类

组蛋白是染色质中核小体的重要组成成分，分为2大类(5种)：一类是核心组蛋白，分别为H2A、H2B、H3、H4；另一类是连接组蛋白即H1。组蛋白修饰包括甲基化(methylation)、乙酰化(acetylation)、泛素化(ubiquitination)、磷酸化(phosphorylation)、SUMO化(small ubiquitin-related modifier)等，这些修饰之间相互作用，在组蛋白的N末端发生共价修饰，因此形成了“组蛋白密码”[5]，这些密码被含有特定结构域的蛋白解读后，能够进一步调控基因转录中激活和沉默等重要的生物学过程[6]。

1.1 组蛋白乙酰化酶及抑制剂

组蛋白乙酰化是目前研究最多的组蛋白修饰种类，在多种类型肿瘤的发生、发展及转移等过程中发挥重要作用。其中，组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)和组蛋白乙酰基转移酶 (histone acetyltransferase, HAT)是染色质重塑、基因表达控制和抗肿瘤研究最多的靶标，组蛋白乙酰化途径主要受到这两类酶调节[7-8]。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDAC inhibitors，HDACi)主要通过改变机体内组蛋白乙酰化状态来调节肿瘤细胞的生长、分化和凋亡，从而表现出抗肿瘤活性[9]。基于组蛋白去乙酰化酶在肿瘤中起着关键的生物学作用，研究者开发出了一系列HDACi，如2006年伏立诺他(vorinostat，SAHA)为第一个被FDA批准上市用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤[10]；2014年贝利司他(belinostat，PXD101)被FDA 批准用于治疗外周T细胞淋巴瘤[11]；苯甲酰胺类的恩替诺特(entinostat，MS-275)作为Ⅰ型HDAC亚型的HDACi被批准上市[12]；2015年帕比司他(panobinosta，LBH589)作为泛组蛋白去乙酰化酶抑制剂被FDA批准治疗多发性骨髓瘤[13]。

在临床试验中，多数HDACi小剂量单药给药时显示出良好的抗肿瘤效果，但是多数HDACi除与Zn2+结合外还与其他金属酶结合，因而缺乏特异性，在很小的剂量下就可发生恶心、呕吐等副作用[14]。因此，急需较高特异性和低副作用的HDACi产生，为临床患者提供更优质的服务。

1.2 组蛋白甲基化酶及抑制剂

组蛋白甲基化主要由组蛋白甲基转移酶(histone methyltransferase，HMT)催化。HMT家族包括组蛋白赖氨酸甲基转移酶(histone lysine methyltransferase，HKMT)和组蛋白精氨酸甲基转移酶(protein arginine methyltransferase，PRMT)[15]。其中HKMT又分为LSD(lysine specific demethylase)和JMJD(JmJC domain-containing family)两个家族。

组蛋白赖氨酸特异性去甲基酶1(lysine specific demethylase 1，LSD1)是一种黄素腺嘌呤二核苷依赖的去甲基酶，能特异性地去除组蛋白H3K4和H3K9的单双甲基化修饰[16]，调控靶基因的表达。我们课题组研究发现，靶向沉默LSD1，能明显减弱结肠癌细胞增殖、侵袭转移能力[17]。因此，靶向LSD1是结肠癌潜在的治疗策略。目前在肿瘤中研究较多的LSD1 抑制剂有苯环丙胺类(TCP)、多肽类(CBB1003)、小分子化合物(NCL1)等。

JMJD组蛋白去甲基化酶能特异性地去除赖氨酸三甲基化的修饰，其抑制剂主要包含：α-酮戊二酸 (2-OG)类似物、基于吡啶(或嘧啶)的抑制剂、异羟肟酸类抑制剂等[18]。

组蛋白甲基化转移酶EZH2是多梳抑制复合体2(polycombrepressivecomplex2, PRC2)介导组蛋白H3(H3K27me3)的催化亚基，H3K27甲基化能够诱导下游基因发生转录抑制并参与相关基因的表达。EZH2表达上调与消化系统肿瘤的发生密切相关，EZH2的表达活性与结肠癌的发生和结肠癌患者的预后紧密相连[19]。

目前，对EZH2抑制剂种类的报道有很多，DZNep是第一个被发现的EZH2 抑制剂，其属于SAH水解酶抑制剂。GSK126在2014年进入Ⅰ期临床试验被用于各种实体瘤、淋巴瘤，对EZH2具有极高的选择性，能够有效抑制对EZH2突变细胞的增殖[20]。虽然GSK126在小鼠的治疗应用中表现出很好的耐药性，但仍然存在着血脑屏障通透性问题[21]。

当前组蛋白甲基化修饰多种酶被认为是抗肿瘤药物的新靶标，其抑制剂在临床前试验中显示出一定的抗肿瘤效果，但仍处于基础实验阶段，未能大规模获得批准投入临床应用，同时，组蛋白甲基化修饰酶抑制剂在临床中的安全性如何尚待进一步研究。

1.3 组蛋白泛素化酶及抑制剂

泛素化是将单个或多个泛素单体的羧基末端共价连接在赖氨酸残基上的氨基的过程。通过泛素化修饰的蛋白质大多在泛素-蛋白酶体作用下发生降解，进而在细胞的增殖、信号转导以及肿瘤发生等生命活动中发挥着重要的调节作用[22]。

组蛋白泛素化通常需要三种酶，包括泛素活化酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)[23]，在去泛素化酶(deubiquitinating proteins, DUBs)作用下此过程可以发生逆向调控。在整个组蛋白泛素化过程中，E3拥有对目的蛋白识别和招募E2的关键作用，并且不同亚型的E3同源性低，对其底物具有高度特异性，在T细胞的调节和肿瘤免疫治疗中发挥重要作用[24]，成为当前泛素系统中的研究热点。

E3主要分为环指(Ring-finger)家族、HECT家族等[25],其中，HECT家族中的UBR5作为泛素-蛋白酶体系统(UPS)的关键调节剂，在结直肠癌[26]、三阴性乳腺癌[27]中呈现高表达水平，UBR5蛋白水平高的患者预后较差，在细胞实验中，敲低UBR5可有效控制肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移，动物实验进一步证实UBR5的敲低降低肿瘤的生长。由此看出，UBR5可能成为结肠癌、乳腺癌等肿瘤潜在治疗和预后的靶点。

当前，广泛作用的蛋白酶体抑制剂已在临床中使用，硼替佐米和卡非佐米进入Ⅱ期临床试验用于套细胞淋巴瘤。但是，关于组蛋白泛素化酶抑制剂在临床中的应用很少报道，相信在不久的将来将会造福于人类。

2 免疫检查点及抑制剂

如今，肿瘤免疫治疗成为继手术、放射、化疗和靶向治疗之后的第五大肿瘤治疗方法，免疫检查点抑制剂最受人们关注，被认为是现代免疫治疗的关键[28]。免疫检查点作为一组对免疫系统进行负性调节的因子，与肿瘤免疫逃逸密切相关。当前，研究者对免疫检查点的针对性研究日渐增多，如细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxic T-lymphocyte antigen-4, CTLA-4)、程序性细胞凋亡蛋白-1(programmed death-1 receptor, PD-1)、B7蛋白家族其他成员等，而PD-1/PD-L1和CTLA-4是目前应用最为广泛的免疫检查点抑制剂靶点。Allison和Honjo因发现CTLA-4和PD-1而荣获2018年度诺贝尔生理奖和医学奖[29-30]。

PD-1又称B7-H1、CD274，属免疫球蛋白B7超家族，是一种重要的免疫检查点[31]，主要在已激活的CD4+、CD8+T细胞、B细胞和NK细胞中表达，可影响树突细胞的抗原提呈能力，并抑制肿瘤微环境中T淋巴细胞参与的迟发性免疫应答[32]，而PD-L1作为PD-1的主要配体，除在淋巴细胞表达外，在诸如黑色素瘤、肺癌、结肠癌等肿瘤细胞表面异常表达并证实可能成为某些肿瘤预后的靶标。

CTLA-4又名CD152，是T细胞表面的跨膜受体，与CD28共同享有B7分子配体。在正常生理条件下，当CTLA-4与抗原提呈细胞表面B7分子结合时，可诱导T细胞发生无反应性，减少因T细胞过度激活所带来的免疫损伤。阻断CTLA-4蛋白结合位点，可减弱Tregs对T细胞的活性抑制作用并能阻断其与抗原提呈细胞表面的配体B7结合，因而能够有效活化T细胞，增强T细胞抗肿瘤效应[33]

当前，pembrolizumab、nivolumab、atezolizumab和avelumab在内的PD-1/PD-L1抑制剂和CTLA-4抑制剂ipilimumab已被FDA批准用于多种肿瘤的临床治疗，但由于肿瘤的异质性和肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)的复杂性，免疫检查点抑制剂治疗的总体有效率较低[34]。

3 组蛋白修饰酶抑制剂联合免疫检查点阻断疗法在相关肿瘤中的研究

众多研究证实，组蛋白修饰酶抑制剂和免疫检查点抑制剂显现出各自积极的抗肿瘤效应，但是单一疗法的局限性严重困扰着肿瘤患者。越来越多的证据支持组蛋白修饰酶及抑制剂具有免疫调节活性，能够调控免疫检查点的表达，介导其抗肿瘤效果，同时发现组蛋白修饰酶抑制剂与免疫检查点阻断疗法之间存在协同抗肿瘤效应。

3.1 组蛋白去乙酰化酶抑制剂联合免疫检查点阻断疗法

HDACi不仅可通过调节免疫细胞来提高免疫应答，而且可提高肿瘤细胞的免疫原性达到消除肿瘤细胞的目的。panobinostat可以提高包括PD-L1在内的肿瘤细胞表面上免疫检查点配体的表达，进而影响免疫检查点阻断疗法的效果[35]。临床前相关研究表明[36]，HDACi以剂量依赖的方式诱导PD-L1的上调，在评估的抑制剂中，panobinostat显示出最大的增强PD-L1表达的能力，为panobinostat和抗PD-1组合治疗提供了依据。

当前，一些关于HDACi联合免疫治疗的疗法在临床试验中表现出令人鼓舞的疗效，然而研究最多的组合为HDACi联合靶向PD-1、PD-L1及CTLA-4的免疫检查点阻断疗法[37]。

Orillion等[38]在肾细胞癌荷瘤小鼠动物实验中发现，与单个治疗组相比，Entinostat和抗PD-1治疗的组合最有效的增强了肿瘤生长的抑制作用。为了将这些观察结果扩展到其他小鼠模型，此团队使用肺癌荷瘤小鼠，用同样的方法发现Entinostat和抗PD-1治疗的组合导致肿瘤生长显著减少。同时，为了检查Entinostat对TME的作用，对各样本进行蛋白组学分析发现Entinostat足以将TME的免疫特性改变为一种抗肿瘤状态，这可能会使TME更好地响应免疫治疗干预措施。另外，Kim等[39]在CT26同基因小鼠中发现，HDAC抑制剂CG-745或抗PD-1单药治疗未显示出肿瘤清除反应，当用CG-745和抗PD-1联合治疗时，CT26同基因小鼠显示出有效的肿瘤生长抑制效应，包括完全的肿瘤清除。为了解CG-745诱导小鼠免疫微环境的变化，随机选择小鼠并分离肿瘤组织，发现CG-745在同基因小鼠中增加浸润的淋巴细胞并减少MDSC细胞,结果显示，CG-745诱导的免疫微环境变化对抗PD-1等靶向药物有益。

为了研究抗CTLA-4和HDACi联合用药的疗效，Llopiz等[40]在皮下接种Hepa129细胞的肝癌小鼠中发现，belinostat单药治疗未显示出任何体内抗肿瘤作用，而抗CTLA-4明显延迟了肿瘤生长，当与belinostat联合应用时这种作用更为明显。抗CTLA-4联合belinostat治疗的小鼠30d存活率为100%，显著高于仅用抗CTLA-4治疗的75%。为了了解其背后的免疫机制，对荷瘤小鼠进行免疫参数分析，抗CTLA-4联合belinostat的抗肿瘤作用增强与M1巨噬细胞早期浸润增加和PD-L1上调有关。这些结果为检测belinostat和抗CTLA-4增强肝癌患者的治疗活性提供了依据。

以上研究证实HDACi和免疫检查点阻断疗法联合应用的抗肿瘤效果，HDACi通过改善TME发挥与免疫检查点阻断疗法联合治疗的协同作用。但是想要确定晚期肿瘤患者的疗效、客观缓解率和无进展生存期，仍需要进行HDACi联合免疫检查点阻断疗法的I/II期临床试验。

3.2 组蛋白甲基化修饰酶抑制剂联合免疫检查点阻断疗法

与组蛋白乙酰化修饰相似，组蛋白甲基化修饰可通过调节肿瘤的免疫原性来调节机体免疫应答[41]。

以LSD1为代表的组蛋白甲基化修饰在肿瘤免疫治疗中扮演了重要角色。Qin等[42]研究发现，在携带三阴性乳腺癌异种移植肿瘤的小鼠中，单独使用抗PD-1抗体未能起到显著的治疗效果。但是，将LSD1抑制剂和PD-1抗体联合使用能明显抑制肿瘤细胞生长和肺转移，这与异种移植肿瘤中Ki-67水平下降和CD8+T细胞浸润增加有关。另外，Sheng等[43]研究发现，仅用PD-1抑制剂对野生型B16肿瘤的生长没有明显影响；但是，在小鼠植入肿瘤后第14天，应用PD-1抑制剂显著降低了LSD1 KO B16肿瘤的生长。此外，当LSD1 KO或对照B16肿瘤达到相同体积时，该课题组向小鼠施用了抗PD-1，以确保PD-1阻断的作用不是由于LSD1 KO肿瘤生长的动力学延迟。在这两种情况下，PD-1抑制剂对降低LSD1 KO肿瘤的生长都具有深远的影响。可见，对于免疫原性较差的B16肿瘤而言，LSD1缺失可增强肿瘤的免疫原性并提高难治性小鼠黑色素瘤对抗PD-1治疗的敏感性。LSD1抑制剂可能是免疫治疗的有效辅助治疗，LSD1抑制剂和抗PD-1之间存在协同作用，对免疫原性较差的肿瘤来说是一种新型治疗策略。

依据EZH2能够调节H3K27的三甲基化抑制Th1型趋化因子CXCL9和CXCL10表达，从而减少效应T细胞在肿瘤中的浸润，Dunn等[44]研究发现，组蛋白甲基转移酶EZH2抑制剂可以使H3K27的甲基化发生逆转，进一步促进CXCL9和CXCL10的表达，增进效应T细胞向TME的浸润，以达到治疗肺癌的目的。值得注意的是，T细胞浸润与黑色素瘤中EZH2-PRC2复合物活性的高选择性有关。Zingg等[45]发现，在小鼠抗CTLA-4免疫治疗中，肿瘤坏死因子α(TNF-α)的产生和T细胞的积累导致EZH2表达增加，从而抑制了自身的免疫原性，EZH2失活可逆转这种耐药性，并与抗CTLA-4协同抑制肿瘤的生长。这些抗肿瘤效应依赖于肿瘤内积累产生的干扰素γ(IFN-γ)使浸润CD8+T细胞的黑色素瘤中PD-1表达显著下降。因此，EZH2在T细胞靶向免疫治疗中起着控制黑色素瘤逃逸的分子开关的作用。

在TME分泌体刺激下，细胞毒性T淋巴细胞中的miR-26a升高会抑制EZH2的表达，从而损害细胞毒性T淋巴细胞(CTL)功能，这表明miR-26a-EZH2轴是一个新的靶点，可以提高基于CTLA的肿瘤免疫治疗的效果[46]。EZH2因在TME中发挥其免疫调节功能，在肿瘤免疫治疗中产生重要作用[47]，相关的临床试验报道较少，需要进一步研究阐述其具体机制。因此，靶向EZH2联合免疫治疗的抗肿瘤疗法面临着新的挑战，值得进一步深入研究。

3.3 组蛋白泛素化酶抑制剂联合免疫检查点阻断疗法

目前，泛素连接酶Cbl-b作为Cbl蛋白家族中的成员，已被确定为免疫反应的关键调节剂，在肿瘤免疫治疗中以Cbl-b为靶点，可以参与CTLA-4在内的免疫调节[48]。Peer等[49]研究发现，Cbl-b缺失能够延迟黑色素瘤小鼠模型的肿瘤生长并延长生存期。此外，在Cbl-b缺失的黑色素瘤小鼠中阻断CTLA-4后可显著提高这些作用。因此，进一步表明Cbl-b可能是有用的临床靶标，靶向沉默Cbl-b或抑制Cbl-b活性联合CTLA-4阻断治疗可能是一种潜在的肿瘤治疗策略。

此外，研究发现I型干扰素受体IFNAR1的水平受IFNAR1泛素化E3连接酶的控制，IFNAR1在人类结直肠癌和结直肠癌的小鼠中发生下调，这是CTL发生免疫耐受的重要因素[50]。Meng等[51]研究表明，E3连接酶F盒蛋白38(Fbxo38)能够调节PD-1的表达，并且通过泛素化-蛋白酶体途径使其降解。在T细胞中条件性敲除Fbxo38不会影响T细胞受体和CD28信号传导，但是由于肿瘤浸润T细胞中PD-1的含量较高，导致小鼠肿瘤生长持续加快，然而，IL-2提升了Fbxo38转录水平，进而下调PD-1的表达水平增强抗肿瘤活性。

以上研究表明，E3与免疫检查点有着千丝万缕的联系，参与调节肿瘤免疫检查点的表达，但是目前组蛋白泛素化处于基础实验阶段，尚未有研制成熟的抑制剂批准上市应用于临床治疗。

4 总结和展望

目前，在临床诊疗中，针对免疫检查点抑制剂途径的免疫疗法已在多种类型的肿瘤中取得了巨大成功。但是，由于肿瘤和个体免疫系统的异质性，包括PD-1/PD-L1在内的单抗在许多恶性肿瘤中仍然显示出较慢的响应速度，严重困扰着肿瘤患者。

众多研究已证实，组蛋白修饰酶抑制剂与免疫检查点阻断疗法联合应用存在协同抗肿瘤效应，甚至提高肿瘤患者对免疫检查点抑制剂的反应率，可在很大程度上提升抗肿瘤效果。但是，当前组蛋白修饰酶抑制剂联合免疫检查点阻断疗法的研究处于细胞和动物等基础实验研究水平，尚未应用于临床研究。因此，需要我们从基础研究中进一步探索二者联合应用对肿瘤影响的机制，加强临床研究以期达到更好的治疗效果。相信在不久的将来，组蛋白修饰酶抑制剂联合免疫检查点阻断疗法将会给广大肿瘤患者带来福音。