炎调方抑制肺泡上皮细胞凋亡减轻肺水肿机制假说

欧阳洋，施 荣（上海中医药大学附属曙光医院，上海 201203）

脓毒症易导致急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征（acute lung injury/acute respiratory distress syndrome，ALI/ARDS），肺水肿是其主要病理生理表现，治疗存难点。肺泡上皮细胞（alveolar epithelial cell，AEC）上的钠水转运系统维持肺泡内外液体平衡。II型肺泡上皮细胞（type II alveolar epithelial cell，AECII）是I型肺泡上皮细胞（type I alveolar epithelial cell，AECI）的前体细胞，脓毒症导致的AEC受损是肺水肿形成及加重的关键。AEC损伤的主要表现为AECII凋亡增加、向AECI分化减少、AECI受损等。研究显示，以caspase-8为中心的死亡受体通路调控AECII凋亡。我们前期研究发现，炎调方能减少脂多糖导致的AECII凋亡，减轻ALI/ARDS大鼠肺水肿。现结合以上研究基础，拟探讨炎调方抑制AEC凋亡、减轻脓毒症致ALI/ARDS肺水肿的机制假说。

1 AEC凋亡与脓毒症导致的肺水肿

脓毒症易诱发脓毒性休克、多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）。脓毒症导致的ARDS其60 d死亡率可达38.2%[1]，探索有效的治疗方案是目前研究热点。脓毒症导致的ALI/ARDS发生涉及多个环节，其主要病理是肺水肿，多种细胞参与ALI/ARDS病理生理过程[2-4]。近年研究发现，AEC在ALI/ARDS发生发展中起重要作用，参与其主要病理生理肺水肿的整个过程[5-7]。脓毒症导致的AEC受损、维持肺泡内外液体平衡能力降低是肺水肿形成及加重的关键。

1.1 脓毒症与肺水肿

ALI/ARDS发生的病理实质是肺泡内及肺间质大量液体产生，最终形成高通透性水肿[8]。脓毒症失控的炎症反应引起多种炎症因子导致AEC受损，大量血管内液渗透至肺间质及肺泡内，导致液体在肺泡内聚集，肺内分流增加，形成严重通气/血流比例失调[9]。中性粒细胞在肺内被激活或破坏，释放弹性蛋白酶等，使弹性蛋白分解，破坏上皮细胞间的紧密连接，增加血管通透性，大量血浆蛋白和活性物质渗透到肺间质中，造成肺水肿[4]。肺泡巨噬细胞合成多种炎性因子，启动炎性级联反应，致肺泡及间质中多形核细胞增加并激活，产生呼吸爆发，破坏AEC细胞膜完整性，使肺泡清除黏液能力下降，肺泡内渗出大量组织间液以及细胞内液，形成肺水肿[10]。在肺部聚集的多种炎性介质可损伤血管内皮细胞，产生血小板活化因子，直接作用在肺血管的内皮细胞膜，使内皮细胞的连接松散、血管的通透性增加形成肺水肿[11]。

1.2 AEC与肺水肿

肺泡是气体在肺进行气体交换的基本单位，肺有数百万个肺泡组成，肺泡仅由两种细胞组成，即AECI和AECII。成人约90%以上的AEC为AECI，其与肺泡毛细血管内皮细胞紧密联系。近年研究发现，虽然AECI具有潜在分化能力，但AECII仍然是AECI前体细胞，对AECI进行补充，在肺泡损伤修复中发挥重要作用。AECI主要功能有维持肺泡结构，与基底膜、肺泡壁毛细血管内皮细胞共同组成血气屏障，负责气体交换。同时，AECI还参与肺泡水、离子及蛋白转运，具有Na+、K+、Cl-等离子的转运功能。研究显示，AECI负责肺部约60%的液体转运[12]。AECII位于肺泡表面的凹陷处，覆盖约5%的肺泡表面，占AEC总数的14%～16%。AECII重要功能为维持正常肺水转运，保障肺泡内外液体平衡[13]。AECII还可以通过合成和分泌肺泡表面活性磷脂和蛋白，维持肺泡表面张力、防止肺泡塌陷。

肺泡和远端气道上皮细胞的主动转运机制是肺泡内液体的主要清除方式[14]。AEC钠水转运系统主要由上皮钠通道（epithelial sodium channel，ENaC）、Na+-K+-ATP酶（NKA）、水通道蛋白（aquaporin，AQP）组成[15-16]。AEC主要通过跨膜转运系统实现肺水转运（肺泡液的吸收和分泌），主要包括ENaC和NKA，过量肺泡液的吸收依赖于NKA和ENaC活性[17]。ENaC是一种跨膜蛋白，由α、β、γ三个同源亚基组成，是肺内液体转运的重要通道，AECII上的钠通道以ENaC-α为主[17]。AECI上也存在ENaC，其钠通道数量是AECII的3倍。AECI覆盖面占肺泡总面积的90%，在钠水转运系中可能比AECII细胞占有更重要的地位[13]。ENaC、NKA和AQP共同使液体被动从空气间层向组织间隙移动，这就是肺泡液体清除。这个过程是肺泡发生水肿后液体重吸收的关键，当肺泡对液体和血浆蛋白的通透性增加时，正因为有ENaC介导的肺泡液体清除，才能维持肺泡高效的气体交换功能[14]。

1.3 脓毒症与AEC

在ALI/ARDS病理生理中，虽然多种炎症细胞及介质参与肺水肿的形成，但AEC对液体重吸收能力是平衡肺部液体的关键，AEC受损与肺水肿的形成与加重密切相关[12,18]。研究显示，AEC损伤贯穿ALI/ARDS渗出期、增殖期、纤维化期始终[3]。AEC受损，转运肺泡内液体能力降低，气体交换能力下降，肺泡表面活性物质合成减少，消耗增加，活性降低以及呼吸膜破坏，最终导致肺泡闭陷，形成及加重肺水肿[19]。

1.3.1 AEC凋亡与脓毒症在ALI/ARDS渗出期、增殖期、纤维化期过程中，AECII凋亡贯穿始终[3,20]。在20世纪90年代，研究者发现 ARDS 患者AEC表现为DNA断裂、染色质浓缩等细胞凋亡特点，调控细胞凋亡的Bcl-2 家族蛋白表达明显升高。随后又发现，在ARDS患者支气管肺泡灌洗液中，与凋亡相关的蛋白Fas/FasL明显升高[21]。研究证实，与脓毒症相关的肿瘤坏死因子α及脂多糖等均可引起AECII凋亡增加[22]。临床研究发现，脓毒症致ARDS死亡患者肺组织中，凋亡相关标记物较非ARDS 病死患者明显升高。动物实验显示，气管内注入脂多糖致ALI大鼠，6 h后即可检测到AEC凋亡增加。抑制AECII凋亡可降低ALI/ARDS小鼠的死亡率[23]。AECII凋亡增加将减弱维持肺泡内外液体平衡的能力，并导致AECII向AECI分化减少，进一步加重肺水肿。抑制AECII凋亡可以减轻由脓毒症诱发的ARDS，改善ARDS预后。

AECI对炎症引起的损伤十分敏感，在脓毒症致ALI/ARDS形成过程中，AECI广泛受损是ALI/ARDS的常见形态学特征，且较AECII更早出现。观察发现，受损的AECI主要表现为细胞顶端膜形成大疱样，肺泡腔可见有残膜及受损细胞脱落。研究显示，当AEC I暴露于与脓毒症相关炎症因子中约8～12 h即出现结构损伤，48 h后绝大部分受损的AECI被AECII替代[24]。在AEC损伤过程中，AECI最早出现，受损的AECI可由AECII迅速进行补充以维持正常功能。转分化的特征在于AECII细胞标记物的下调、AECI细胞标记物的上调和细胞扩散，导致形态从立方形变为鳞状，从而恢复正常的肺泡结构和功能[25]。AECI损伤直接导致钠水转运系统功能降低，AECI维持肺泡液体平衡能力下降，大量液体在肺泡内聚集，加重肺水肿。

1.3.2 caspase-8与AEC凋亡细胞凋亡指机体为了维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主且有序的死亡。有三种细胞凋亡信号传导途径，分别为外源性（死亡受体介导凋亡）信号通路、内源性（细胞线粒体介导凋亡）信号通路以及内质网应激相关途径。死亡受体通路是比较成熟的通路，目前有5种死亡受体被发现，分别为肿瘤坏死因子受体1（tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）、凋亡相关因子Fas、死亡受体3（death receptor 3，DR3），肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体-1（TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor 1，TRAIL-R1）或DR4，TRAIL-R2或DR5。caspase是一种促使细胞凋亡的蛋白酶[26]，在细胞凋亡机制网络中处于核心地位[27]。研究显示，死亡受体通路与AECII凋亡密切相关，Fas、TNFαR、DR3等死亡受体均可被各自的配体激活后，最终活化caspsae-8，诱发凋亡[28-29]。死亡受体通路主要通过三条途径调节细胞凋亡：TNFR途径、TRAIL途径、Fas/FasL途径。caspase-8参与三条途径发挥作用。①TNFR途径。TNF-α通过TNFR-I和TNFR-II介导其生物学活性，最终激活caspase，caspase发生级联反应，从而激活死亡受体通路。②TRAIL途径。公认的TRAIL受体至少 有5种：TRAIL-R1（DR4）、TRAIL-R2（DR5）、TRAIL-R3（LIT，DcR1）、FRAIL-R4（TRUNDD，DcR2）、可溶性的护骨素。DR4和DR5的配体使细胞发生凋亡，TRAIL通过黏附于DR4或DR5使受体发生三聚化，形成死亡诱导信号复合物（death-inducing signaling complex，DISC）。caspase-8可被DISC激活。激活的caspase-8通过两条凋亡信号途径发挥作用，促进细胞凋亡，其一是caspase-8直接激活caspase-3、caspase-6、caspase-7，经外源性途径诱导凋亡。其二是caspase-8通过激活Bid与线粒体连接，激活内源途径诱导凋亡。③Fas/FasL途径。Fas/FasL诱导的细胞凋亡是由细胞表面的Fas受体与FasL三聚体结合，通过一系列级联反应，最终形成DISC。procaspase-8被激活分解成有活性的caspase-8，有活性的caspase-8和caspase-l0片段可以继续激活其下游的caspase级联反应，从而使细胞发生凋亡。

2 炎调方抑制AEC凋亡减轻肺水肿假说

2.1 炎调方立方依据

ALI/ARDS以进行性低氧血症和呼吸窘迫为特征，其主要中医临床证候为喘促、高热、便秘、舌绛、脉滑数等，可归属于中医“喘证”“结胸”“暴喘”“喘脱”等范畴。当前中医治法多以清热化痰、泻肺通腑、解毒祛瘀、补虚固脱、益气利水等法[30]。综合研究发现，中西医结合治疗本病优势明显。

近年来，我们一直从事中西医治疗ALI/ARDS，通过总结分析，综合各医家所长，认为脓毒症所致ALI/ARDS患者，虽症状各异，然其病机相同，皆由外感热毒传里，热毒积聚，毒陷入腑，容于营血所致，腑实营热乃其病机。基于以上理论，通腑清营法切中该病病机。并自拟炎调方（生大黄、芒硝、桃仁、赤芍、玄参、当归、银花、连翘、麦冬）应用于临床治疗脓毒症所致ALI/ARDS。方中生大黄、芒硝、桃仁具有釜底抽薪、通腑存阴之功，共为君药；赤芍、玄参清营泻火、凉血滋阴，为臣药；银花、连翘清热解毒，轻清透泄，使营分热邪有外达之机，促其透出气分而解，此即“入营犹可透热转气”之具体应用；佐以麦冬补其耗伤之津，当归活血通便，全方配伍共奏通腑清营之功。

2.2 炎调方与脓毒症致ALI/ARDS

脓毒症的始发因素是感染，感染所引起失控的炎症反应导致大量炎症介质及细菌毒素入血，在肺部聚集，是形成ALI/ARDS的关键。因此，治疗的焦点除积极抗感染外，也聚焦在清除爆发的炎症介质，缓解失控的炎症反应方面，以期减轻肺水肿，纠正低氧血症。近年来，我们前期研究从炎症反应入手，通过临床观察，我们发现炎调方能有效降低脓毒症患者血清多种炎症介质如IL-2、TNF-α、IL-6等的水平，提高ALI/ARDS患者氧合指数水平，缩短机械通气治疗时间[31-33]。以上结果说明，炎调方能有效治疗脓毒症致ALI/ARDS患者。

2.3 炎调方-AEC凋亡-肺水肿

同样，我们开展了基础研究，通过盲肠结扎穿孔术对大鼠进行ALI/ARDS造模，随着时间延长，电镜下可见模型组大鼠肺组织肺泡壁充血、增厚，肺泡内及肺间质水肿范围扩大，肺组织明显实变。与模型组相比，炎调方组可见病变范围较小，肺实变较轻。以上结果提示炎调方能减轻ALI/ARDS大鼠肺水肿，保护大鼠肺组织[34-35]。为进一步明确其减轻肺水肿的机制，我们从细胞水平也进行了实验，我们原代分离并培养AECII细胞，通过加入脂多糖模拟ALI/ARDS体外模型，炎调方能明显减少脂多糖导致的AECII细胞凋亡。同时结果还显示，脂多糖能明显激活AECII细胞caspase-8和caspase-3活性，提高Fas和FasL的水平；当加入炎调方药物血清后，以上凋亡相关蛋白表达水平能被炎调方明显抑制，提示炎调方能抑制AECII凋亡可能与抑制caspase-8活性以及Fas和FasL的表达有关。但炎调方减轻肺水肿的具体机制仍待进一步明确。为深入探索炎调方减轻脓毒症致ALI/ARDS肺水肿的机制，我们提出以下假说：炎调方通过死亡受体通路及caspase-8抑制AECII凋亡，并促进AECII向AECI转化，防止AECI受损，维持肺泡内外液体平衡，从而达到减轻肺水肿，保护肺组织的作用。

3 结语

综上所述，AECI和AECII共同维持肺泡内外液体平衡，AECII是AECI的前体细胞，对AECI进行补充。肺水肿是脓毒症致ALI/ARDS的核心病理，脓毒症导致AECI受损和AECII凋亡增加引起肺泡液体代谢失衡是肺水肿形成及加重的关键；死亡受体通路及caspase-8调控AECII凋亡。我们前期研究显示，炎调方能减轻脓毒症致ALI/ARDS肺水肿，抑制脂多糖诱导的AECII凋亡。但有关炎调方抑制AECII凋亡的机制，炎调方是否对AECI有保护作用，对AEC钠水转运系统是否有调控作用等仍有待进一步明确。结合以上研究进展，为深入探索炎调方减轻脓毒症致ALI/ARDS肺水肿的机制，我们提出以上假说。今后工作中拟从体内、体外实验相结合，进一步证实以上假说，为中医药治疗脓毒症致ALI/ARDS提供理论及实验依据。