程序性死亡通路在胆红素脑病机制中的研究

阳华妹

（桂林医学院第二附属医院新生儿科，广西 桂林 541199）

细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）是机体为维护内环境稳定，由多种基因调控的细胞自主有序的死亡，目前共发现有5种死亡类型，具体信号转导机制未完全阐明。目前对非结合白蛋白的胆红素（unconjugated bilirubin with albumin，UCBA）介导脑损伤的研究涉及细胞凋亡、细胞焦亡、细胞自噬。胆红素脑损伤的分子机制，新生儿血液中高浓度的UCBA可进入血脑屏障，主要作用于中枢神经核团的神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞等[1，2]，通过细胞膜和内质网、线粒体膜，介导中枢神经细胞的氧化应激反应、兴奋性氨基酸、线粒体的能量衰竭、钙信号传导异常、细胞周期改变、半胱天冬酶激活等下游事件，引起中枢神经细胞程序性死亡和炎症反应导致脑损伤[3，4]。本文重点就其中信号通路的标志物的研究进行综述，为深入研究胆红素脑病的发病机制提供新的视角，利于进一步研究胆红素脑病的干预靶标。

1 细胞凋亡

1.1 细胞凋亡的特点 1972年Kerr发现钙信号异常诱发大鼠前列腺退化中的凋亡细胞缺失而提出，细胞凋亡参与多系统疾病的发病机制，形态表现为死亡的细胞膜损坏，萎缩，胞质浓缩，核染色质固缩，DNA降解，有凋亡小体，特点是无炎症反应[5]。凋亡依赖Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白系统与促凋亡系统的调控，活化的半胱天冬酶Caspase-3、Caspase-12为最终效应蛋白，共有3种信号通路途径，目前研究最成熟，但具体的信号转导机制仍未完全阐明。

1.2 细胞凋亡的信号通路

1.2.1 线粒体途径（Ca2+-Caspase-9-Caspase-3通路）直接的触发机制[4，6]：线粒体通透性转变孔（mitochondrion Adrian permeability transit ion pore，MPTP）过度开放[4]，线粒体膜上的Bcl-2家族中的Bad（非磷酸化的）联结Bax的同型二聚体，使Bax发生构象变化，形成单聚化并转移至线粒体外膜，引起MPTP的开启。信号通路：①Ca2+内流和细胞色素C（cytochrome C，Cyt C）释放，MPTP反应开放使线粒体的Ca2+内流，Cyt C从线粒体释放入细胞质和活化，导致跨膜电位降低、ATP合成减少及下游的半胱天冬酶前体（procaspase）活化。②凋亡小体形成：Cyt C释放后与Apaf-1形成Apaf-1/Cyt C复合体，复合体使Apaf-1发生构象变化，促进复合体与ATP/dATP的结合，激发其多聚化，从而形成凋亡体（apoptosis body）。细胞凋亡的启动：凋亡体募集胞浆中的procaspase-9，通过自剪切激活后启动Caspase的级联反应，继续活化下游Caspase-3、7等，并形成正反馈。细胞凋亡的执行：活化的Caspase-3能对其底物进行特异性切割，使DNA形成碎片，致使细胞凋亡。调控：Bcl-2家族：抗细胞凋亡的蛋白：Bcl-2、Bcl-x（L）等，如活性下调则促进细胞凋亡。Bcl-2同源结构域（BH1，BH2，BH3，BH4）：该酶无活性，但可增加线粒体膜的通透性。促细胞凋亡的蛋白：Bax，Bak，以及Bid，Bim，Bad等（只含有BH3结构域）等。国内外己有大量胆红素脑病的哺乳动物模型中检测到线粒体途径的信号分子，证实了非白蛋白结合的胆红素诱导Bax表达[6，7]，控制线粒体膜的通透性和跨膜电位，破坏细胞内钙稳态致Ca2+信号异常[3，8]，促使Cyt C释放、活化的Caspase-9、Caspase-3表达及细胞形态改变，导致细胞凋亡[9]。并且凋亡抑制剂能减轻胆红素诱导的神经毒性[7]。

1.2.2 死亡受体活化途径（Ca2+信号—Caspase-8-Caspase-3活化途径）细胞内Ca2+浓度升高，激活并连接钙调磷酸酶，使肿瘤坏死因子超家族转录因子去磷酸化，启动受体活化途径[10]。目前发现的死亡受体途径主要有3种，其中UCBA介导的中枢神经细胞凋亡的死亡受体活化途径目前仅有2种报道。其共同特点为死亡受体与特定的配体相结合，发生三聚化和构象变化，通过死亡结构域（death domain，DD）与其它连接蛋白组成复合物，死亡结构域相关的Fas蛋白（fas protein associated with the death domain，FADD）和TNFR蛋白TNFR-associated protein with death domain，TRADD），或死亡效应区（death effector domain，DED）等结合组成复合物，激活procaspase-8，之后分别通过两种途径最终激活procaspase-3，活化的Caspase-3引起细胞凋亡。①Fas/Fasl途径：自杀相关因子（factor associated suicide，Fas）与其配体（factor associated suicide brigands，Fasl）是经典的途径[10]，细胞表面的Fas受体与Fasl的三聚体结合，募集DD、FADD的DED，集合procaspase-8的DED，形成死亡诱导信号复合体（death-induced signaling complex，DISC），从而激活procaspase.8，使其水解、切割成活化的caspase-8，再激活下游不同的Caspase级联反应，激活caspase-3，经外源性途径诱导凋亡；或Caspase-8切割位于胞浆的Bid，截断成Bid（bid），bid通过3-OH端与线粒体连接，诱导Cyt C释放，激活前述内源性（线粒体）途径诱导细胞凋亡。研究发现，暴露于高浓度UCBA的鼠脑组织或神经元中的细胞凋亡信号分子Fas/Fasl和Caspase-3、Caspase-8的过度表达，以及Bid被切成截短的Bid（bid）[9，11]，表明UCBA介导了中枢神经细胞凋亡的Fas/Fasl途径，引起细胞凋亡。但对于UCBA介导这一信号通路途径中的完整的基因检测的研究罕见报道。②TNFR途径：TNFR1（tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）与TNF结合成三聚体，集合TRADD、FADD、TRAF-2和RIP1，FADD依次激活caspases.8、caspase.3促凋亡[12]。复合物I形成及泛素化使NF-KB，抑制凋亡，TNF联结DD与TNFR1后发生三聚化，集合TRADD和其它蛋白，如TNF-α 相关因子2（TNF receptor associated factors，TRAF2）、细胞凋亡抑制蛋白（cell ular inhitor of apoptosis protein，cIAP）cIAP1、cIAP2、受体相互作用蛋白1（receptor interacting proteins，RIP1），形成复合物I结合到质膜上。复合物I激活NF-κB和AP-1。非降解性多聚泛素链修饰RIP1等衔接蛋白，形成泛素化状态。泛素化激活IkB激酶（kappaKinsey，IKK），将NF-κB抑制蛋白IkBa磷酸化后，IkBα 被泛素蛋白酶复合体降解，使NF-kB激活后移位到细胞核并转录，诱导细胞凋亡抑制蛋白（inhibitor of apotheosis protein，IAP）如 cIAP -l、cIAP -2、cFLIP、TRAFl、TRAF2等的转录[6]。去泛素化和DISC形成，激活Procaspase-8，发生细胞凋亡，去泛素化酶降解多聚泛素链修饰RIP1的反应，使其去泛素化，聚合RIP3以及TRADD、FADD、Procaspase-8组成复合物11（即DISC），Procaspase-8活化，使RIP1、RIP3剪切失活，进而激发前述2种内源性和外源性途径[4]，最终形成caspase-3，诱导细胞凋亡[12]。DISC形成后，如NF-kB如被激活，cFLIP转位到DISC，阻止Procaspase-8的激活，从而抑制细胞凋亡，反之促凋亡。抑制Caspase可阻止RIP1泛素化，刺激DISC复合物的形成[12，13]，促进细胞凋亡。国外研究发现[9，14]，大鼠星形胶质细胞体外暴露于UCBA中会增加TNFR途径中的TNFR1和NF-KB、IL-1β、Caspase-8、Caspase-3的表达；而使用FNFR1基因沉默技术可在短时间内降低胆红素诱导的细胞死亡。这些实验结论支持了TNFR信号通路在胆红素脑损伤机制中的重要作用[9，13]，但具体的信号转导机制未进行深入研究。

1.2.3 内质网应激（ER stress，ERS）ERS是近年发现的细胞凋亡信号通路。ER是细胞内蛋白质的合成及折叠、聚集的场所。内环境紊乱或损伤因素可引起非折叠的蛋白或错误折叠的蛋白在细胞内过多地聚集，启动一系列基因表达，引起ERS，以促进损伤的修复，严重ERS则促进损伤效应，引起细胞凋亡。目前对其信号通路的研究主要是非折叠蛋白的反应（unfolded protein reaction，UPR），并与线粒体途径和死亡受体活化途径相互作用[18]。UPR-Caspase-12活化途径[14，15]3个代表非折叠蛋白的反应的标志性分子（内质网跨膜蛋白IRE1、aATF6、PERK）与免疫球蛋白结合蛋白葡萄糖调节蛋白78（glucose regulating protein78，GRP78）/Bi的解离，促进中间信号分子c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal Kinsey，JNK）、CHOP、Bcl-2家族的活化，最终启动Caspase-12活化，具体信号通路如下：CHOP：从GRP78/Bi解离的R样内质网激酶蛋白激酶（protein Kinsey R-like ER Kinsey，PERK）被磷酸化，并依次激活真核起始因子2（eurydice imitation factor-2，eIF2）、eIF2、ATF4；肌醇需求酶1-a（luminosity-requiring enzyme 1，IRE1-a）；依次激活TRAF2、ASK1、P38蛋白激酶（P38MAP）；激活转录激活因子6（activating transcription factor 6，ATF6），经高尔基体作用生成P50 ATF6。此3条途径均能激活CHOP，激活的CHOP过多聚集在细胞核内，直接促进细胞凋亡，下游信号转导机制不明。另外CHOP、JNK还可通过上调Bcl-2家族BH3-only蛋白，以及促进内质网上的Ca2+向细胞质释放，进入线粒体/死亡受体凋亡信号途径。JNK：JNK通过2种方式依次激活IRE1-a、TRAF2、ASK1，或通过激活Fas从而激活JNK，促进细胞凋亡：JNK通过磷酸化Bcl-2、Bcl-xL，抑制其抗凋亡作用；或使Bid、Bim磷酸化，加强其促凋亡作用。Caspase-12 ERS时，IREla激活募集的TRAF2，切割活化的Caspase-12，并依次使procaspase-9、procaspase 3被活化，使DNA被剪切，发生细胞凋亡。UCBA与中枢神经内质网应激研究，近年来，国内外较多哺乳动物研究发现，UCBA诱导中枢神经的信号 分 子CHOP RNA、GRP78、PERK、IRE1-a、eIF2、ATF6、IRE1-a、c-Jun、Caspase.12、JNK等的过表达，其基因变化符合内质网应激和未折叠的蛋白反应的全组基因组地表达[16]，证实在胆红素脑损伤的机制中内质网应激有重要作用，内质网应激的抑制剂可能是降低胆红素UCBA诱导的神经毒性的潜在治疗方法[17]。

2 细胞自噬

特点是细胞内物质被自噬泡（双层膜结构）包裹，并与溶酶体融合，形成自噬溶酶体，之后细胞内物质被降解利用。内环境紊乱等因素促进自噬地激活，抑制细胞凋亡，如失控则引起自噬性死亡。

2.1 信号通路启动 MTOR-BULK-III级P13K等复合体通路，饥饿、缺氧、ERS、雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapacity，MTOR）抑制剂下，AMPK活化，MTOR失活[2，18]。活化的AMPK催化复合体ULK（成分：mAtg13、FIP200、ULK1、ULK2）的多位丝氨酸（317、467、555、574、637、777）发生磷酸化[19]，促进自噬。如AMPK失活，第757位丝氨酸与MTOR结合使其活化，则抑制自噬。

2.2 复合物和自噬体 Beclin-1（酵母Atg6同源物）结合P150（酵母Vps15同源物）和hVps34、Bark或抗紫外线照射的基因（UVRAG）共同组成III级P13K复合体[19]，是与自体吞噬相关的基因。自噬体的生成需Atg12-Atg5结合微管相关蛋白II轻链3（microtubule -associated protein light chain 3 -II，LC3-II）形成复合物：Atg12-Atg5形成需Atg7和Atgl0泛素样反应，继而Atgl2-Atgl25连接。LC3的C端被Atg4蛋白所酶切之后生成LC3-I（需磷脂酰乙醇胺和LC3-I连接Atg3和Atg7），自噬体膜吸附连接后的LC3-I和LC3-II。然后，Atg12-Atg125与Atg6组成更大的复合物。

2.3 上游UPR调控通路 研究发现[2，18]，细胞自噬是ERS的下游通路。ERS通过PERK、IRE1、ATF6途径诱导自噬，PERK激活磷酸化的eIF2，活化Atg12触发自噬；IRE1通过与胞浆衔接TRAF2激活JNK，上调Atg5、Atg7，均导致LC3-I向LC3-II转化增加，LC3-II增多促进自噬。胞腔内Ca2+通过活化依赖钙调蛋白的蛋白激酶（the protein kinase that dependent calmodulin），激活AMPK，使MTOR的活性降低，诱导细胞自噬[19]或Ca2+通过抑制自噬体的降解促进细胞自噬[2]。内质网局部产生的R0S可激活JNK，也促进细胞自噬。但细胞缺氧时，ATF4直接与AMP反应元件结合蛋白（cyclic-AMP response element binding protein，CREB）结合，使LC3-I向LC3-II转化，促进ERS以及依托ATF4的细胞自噬。国外部分研究发现[2，18]，鼠的胆红素脑病模型中LC3-I向LC3-II转化，UCBA诱导人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y自噬的模式为钙/PKC信号传导、内质网应激、MTOR失活。以上研究证实了细胞自噬在胆红素脑病中的作用。自噬是未连接白蛋白的胆红素诱导ERS的下游通路及晚期事件，有研究发现人和鼠模型中自噬促生存，也有少数研究发现胆红素早期诱导细胞自噬促进存活，后期促进死亡。

3 细胞焦亡

3.1 细胞焦亡的特点 细胞焦亡是近年新发现的一种高度炎症性的细胞程序性死亡；在形态上与凋亡相似，但同时伴随炎性介质释放，这一特性又与坏死相似[22]。

3.2 信号通路 主要包括经典途径和非经典途径。经典途径：Caspase.1作为关键酶被激活后促进底物的剪切和多聚化，底物包括多种Mastermind（GSDM）家族成员。其中GSDMD被Caspase-1剪切后，通过N端成孔结构域（PFD）多聚化，导致细胞膜出现孔隙[23]，引起细胞焦亡；此外，Caspase 1还能切割炎症因子的前体，使pro-IL 1β 和pro-IL 18活化成IL 1β 和IL 18，引起炎症反应，同时通过多种炎性通路诱导细胞死亡，加重细胞焦亡的损伤级联[22，24]。非经典的信号通路由激活Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11来实现。抑制细胞孔隙的形成是阻断细胞焦亡的关键[23]。

3.3 UCBA介导的中枢神经细胞焦亡地研究 重庆大学华子瑜团队的研究证实了未连接白蛋白的胆红素诱导鼠大脑皮质星型胶质细胞和海马组织中细胞焦亡关键酶Caspase-1的活化，以及脑组织中细胞焦亡相关炎症因子IL 1β、IL 18和炎性小体NLRP3的表达增高，DNA断裂细胞增多，并发现Caspase-1抑制剂阻断细胞焦亡的作用[24]，初步证实细胞焦亡参与了胆红素介导的脑损伤的发病机制，目前尚未发现进一步深入的研究。

4 总结

UCBA诱导神经细胞程序性死亡的信号通路中，各信号通路在内质网、线粒体和/细胞膜水平通过钙信号、Bcl-2/Bax系统、JNK和炎症因子关联和调控，而Caspase-3是多种级联反应的关键的蛋白酶和最终效应蛋白，机制复杂，且3种程序性细胞死亡均为一般情况下的促生存，和失控情况下的促死亡，故研究某种干预作用时需观察对各种细胞程序性死亡方式的影响。并需动态观察细胞形态、基因表达、血清标志物，结合临床表现多种方式来研究，切忌片面化，未来需进一步深入探讨。