基于肿瘤免疫微环境的肝癌分子分型研究进展

刘菲 综述 隋红 审校

肝癌是全球第五大常见癌症[1]，其中肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的肝癌组织学类型，晚期HCC全身治疗效果仍然有限，近年来免疫检查点抑制剂(Immune checkpoint checkpoint inhibitors，ICIs)治疗显示出独特的优势[2]，但由于高度抑制的免疫微环境[3]，ICIs疗效受到严重影响；且HCC异质性的存在导致不同患者对ICIs治疗的反应不同[4]，可见对可能受益于ICIs的HCC患者重新分型尤为重要。基于多组学数据分子水平上的分型忽视了肿瘤免疫微环境(Tumor immunological microenvironment，TIME)的重要作用[5-9]，最近陆续提出基于TIME的肝癌分子分型，不仅反映了HCC患者的基因和免疫学特征，更是指导精准治疗的基础。本文就TIME相关的肝癌分子分型的最新研究做一综述，并讨论这种分型对免疫治疗的指导意义。

1 TIME分子分型

1.1 根据浸润性免疫细胞丰度的分子分型

2017年Sia等[10]首次通过分析956名HCC患者基因表达谱，发现近25%的HCC患者属于“免疫类”，分子特征包括免疫细胞的高度浸润，程序性死亡-受体1(Programmed death-1，PD-1)和程序性死亡-配体1(Programmed death ligand 1，PD-L1)的表达，以及活跃的IFN-γ信号，缺乏CTNNB1突变。将免疫类分为免疫激活亚型和免疫衰竭亚型。免疫激活亚型显示出T细胞受体G、CD8A、IFN-γ等的过度表达，总生存率高；而免疫衰竭亚型则以促瘤信号(如激活的间质、T细胞衰竭和免疫抑制成分)为特征，表达免疫抑制的基因，这些基因受TGF-β1调控，这类亚型更高表达PD-1/PD-L1，可能更受益于ICIs治疗，并发现它与Hoshida等[7]的S1亚型关联性强，预示不良预后。此外还发现约25%的HCC为免疫豁免型，其特征为CTNNB1突变、T细胞缺乏和PTK2的过度表达，对ICIs治疗不应答；其余约50%的HCC介于免疫类和免疫豁免型之间，属于免疫中间类型。

同年，癌症基因组图谱(TCGA)团队分析196例HCC核心样本，发现22%的HCC表现出高或中等水平的免疫浸润现象，在癌组织中存在两个免疫水平较高的High1和High2亚型，高表达包括细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)、PD-1和PD-L1在内的66种免疫标记物，提示ICIs治疗可能适用于这类患者[11]。

基于以上分型，2018年Shimada等[12]进一步综合分子、临床病理和免疫学特征，基于183个HCC样本提出MS1、2、3三种亚型。MS1亚型分子特征是EPCAM、CD133和CK19的上调以及Treg的富集，p53突变和染色体不稳定发生率高，分化差，与血清甲胎蛋白(AFP)、侵袭性血管侵犯、VitK缺乏有关。EPCAM、CD133和CK19是HCC干细胞标志物，具备自我更新和较高侵袭力，EPCAM逃逸CD4+T淋巴细胞依赖性免疫反应，促进肿瘤形成，三者表达上调参与HCC恶性进展，提示预后不良，因此MS1亚型的HCC患者生存率更低。同时发现这类分型与转录组分型具有一定相关性，MS1与ClusterA[5]、Hoshida S1和S2[7]、Boyault G1/2和G3[8]以及增殖亚类[6]相关联，此类患者预后差。MS2亚型存在CTNNB1突变，激活Wnt/β-catenin通路，属于免疫抑制亚型，在免疫学上表现为“冷”，MS2与Cluster B[5]、Hoshida S3[7]、Boyault G5/6[8]和CTNNB1[6]相关联，预后较好。而MS3在免疫学上表现为“热”，由具有代谢危险因素(如肥胖、糖尿病、血脂异常)的HCC患者构成。MS3亚型又分为免疫类MS3i和非免疫类MS3n，MS3i亚型患者的无病生存期(DFS)优于MS3n亚型患者，且MS3i亚类CD8+T细胞浸润显著较低，激活的M1和M2巨噬细胞强烈浸润MS3i肿瘤，从而表现出较好预后。

随后，2018年Kurebayashi等[13]综合分析158例HCC样本的919个区域的免疫微环境及其瘤内异质性，将其分为免疫高、中、低三种亚型。免疫高亚型表现为B/T细胞、浆细胞浸润增加，属于独立的阳性预后因素，具有正相关性。其特征是低分化，CK19和SALL4阳性，与Hoshida S1[7]和Boyault G2[8]亚类显著相关，且与肿瘤和免疫细胞(主要是CD8+T细胞、巨噬细胞)中PD-L1表达显著相关。SALL4也属干细胞标志物，有监测肿瘤生长、转移、侵袭、上皮间质转化指标的功能，SALL4+和CK19+的HCC患者侵袭性强，分化差，无复发生存期更短，但基于TIME分子分型的的预后判断与传统组织病理学和分子分类对预后的认知不尽相同，从提供的研究数据可以发现在低分化HCC和CK19+和SALL4+高级别HCC中，免疫高亚型在术后1 000、2 000和3 000天的无病生存率均为100%，同免疫中、低亚型相比较具有统计学差异(P值分别为0.0024和0.041)，因此免疫高亚型在低分化、CK19+和/或SALL4+高级别HCC中显示出明显更好的预后[14]。免疫中亚型以T细胞和其它免疫细胞浸润适度增加为特点，而B细胞和浆细胞浸润较少。免疫低亚型则只有少量免疫细胞浸润，与Hoshida S3[7]和Boyault G6[8]显著相关，预后较差。这项研究发现了临床病理分类和免疫反应之间存在相关性，说明免疫反应相关的特征可用于临床病理分类。

1.2 根据浸润性CD8+T细胞PD-1表达的分子分型

克服PD-1免疫疗法的局限性需要更好地理解TIME中的T细胞衰竭。2018年Kim等[15]根据PD-1表达水平，将浸润性CD8+T细胞群分为3个亚组：PD-1高、中亚群和PD-1阴性亚群，进一步将PD-1高亚群分为高PD-1表达者和低PD-1表达者，高PD-1表达者与更具侵袭的肿瘤生物学特征和生物标志物相关，可预测对PD-1治疗的疗效反应，这类肿瘤直径较大，AFP水平较高，在肿瘤浸润性CD8+T细胞上表达PD-L1、TIM3、LAG3，与低PD-1表达者相比，PD-L1表达、PD-L1 CPS≥1在高PD-1表达患者的肿瘤细胞和瘤内炎症细胞中更高，这表明高PD-1表达者可能对抗PD-1治疗反应更好，且PD-1高表达者CD8+T细胞更易受到基于ICIs联合阻断的影响，其功能可能会进一步恢复。

1.3 根据多组学的分子分型

2019年Zhang等[16]分析8例HCC患者的42份样本，基于基因组、转录组、蛋白质组、代谢组和现象组(局部免疫状态)揭示了新的基于TIME的分类，包括免疫活性亚型、免疫缺陷亚型、免疫抑制亚型。免疫活性亚型具有相对正常的T细胞浸润，而B细胞浸润少见，主要表现为Breg的减少，且此亚型中尿素循环产生的精氨酸可调节T细胞代谢，抗肿瘤免疫力强，预后好[17]。免疫缺陷亚型淋巴细胞浸润较少，使ICIs发挥疗效的空间更加局限，而树突状细胞和自然杀伤细胞频率较高，这类亚型类似于“冷”肿瘤，与免疫抑制亚型相比具有更好的预后。免疫抑制亚型的特征是淋巴细胞浸润正常，但免疫抑制细胞表达频率更高，PD-1/PD-L1、TIM3和CTLA-4表达上调，此亚型肿瘤细胞更倾向于有氧呼吸，可以产生更多的ATP，当ATP被释放到肿瘤微环境中可发挥免疫抑制因子的作用，因此预后较差。

1.4 根据免疫抑制互斥机制的分子分型

临床免疫学的复杂性特别是HCC瘤内免疫细胞浸润的异质性免疫特征促使对TIME进行更细致的分类。2020年Fujita等[18]基于免疫抑制的互斥机制，分析234例HCC患者的转录组和全基因组数据，获得了TAM、CTNNB1、溶细胞活性(Cytolytic activity，CYT)和Treg四种亚型，后两种属于炎性肿瘤。在结直肠癌中，已经报道了炎性肿瘤预后较非炎性肿瘤好[19]，并且炎性肿瘤内Treg的减少可以增强抗肿瘤免疫反应[20]，且CYT亚类PD-1、PD-L1表达最高，因此可以推测Treg亚类对ICIs治疗的反应劣于CYT亚类。Treg和TAM均被免疫抑制白细胞浸润，预后不良。CTNNB1亚型的特征目前已达成共识[6，10]，而TAM亚型分泌TGF-β1，可诱导细胞外基质和免疫抑制[21]，另外还存在ARID2突变，可使M2型巨噬细胞明显增加。这种分类同样与转录组分型存在联系，TAM亚型的标志性蛋白在Chiang等[6]的“7号染色体的多倍体(Polysomy of chromosome 7)”亚型中过表达；CTNNB1、CYT和Treg亚型的标志性蛋白在Chiang等[6]的“CTNNB1”、“干扰素相关(IFN-related)”炎性亚型中过表达；Treg亚型的标志性蛋白在Hoshida S1、S2[7]亚型中过表达，CTNNB1亚型的标志性蛋白在Hoshida S3亚型中过表达。

1.5 根据广谱免疫细胞的TIME异质性分子分型

先前的研究[22]没有覆盖不同免疫细胞之间作用机制的复杂性，将它们作为一个整体考虑是必要的。2021年Liu等[23]首次从广谱免疫细胞的角度系统研究TIME的异质性，将其分为异质性不同的TIME-1、TIME-2、TIME-3亚型，分别对应免疫缺陷亚型、免疫抑制亚型和免疫激活亚型。其中TIME-1型以自身具有增殖特征和免疫细胞浸润少为特征，表现为TP53、CDKN2A、CTNNB1、AXIN1和FOXD4基因突变，CDKN2A基因突变在HCC中常见，可抑制CDK4/6的促肿瘤行为，因此推测TIME-1型HCC患者对CDK4/6抑制剂更敏感；TIME-1在索拉非尼相关靶基因中表达最高，对索拉非尼更敏感，但相对于其他两种亚型来说，TIME-1的预后最差。TIME-2亚型的特征是免疫抑制细胞增多，PI3K通路显著改变，如PI3KCA、VEGFA和PTEN，其中VEGFA的扩增显著[24]，因此TIME-2亚型可能对贝伐珠单抗敏感。而TIME-3亚型表现为大量免疫细胞浸润和激活，以ARID1A突变为特征[25]，其失活突变导致CD8和PD-L1显著增加，对PD-L1抗体敏感，因此TIME-3对免疫治疗反应更好，预后最佳。

2 免疫微环境分型与免疫治疗

基于TIME特征，研究者们发现上述部分亚型的分子特征变化与免疫疗法的选择及其预后显著相关。例如，Sia[10]和TCGA团队[11]均发现的免疫反应活跃亚型高表达PD-1/PD-L1，可从生存获益角度预测ICIs的反应，并且IFN信号活跃的肿瘤表现出的免疫类别可能是免疫治疗的受益对象；而免疫排斥类PTK 2过度表达，PTK 2是一种与T细胞向肿瘤浸润不良相关的致癌途径[26]，猜想通过干预这一致癌途径可使此类病人受益。免疫排斥类、MS2、Fujita等[18]的CTNNB1类和TIME-1亚型都存在CTNNB1突变，CTNNB1突变的患者在微环境中表现为免疫豁免，可能无法从免疫治疗中获益，但进一步发现CTNNB1突变与果糖二磷酸醛缩酶A(Fructose-1，6-bisphosphate aldolase，ALDOA)第36位丝氨酸的磷酸化相关，ALODA具有促细胞增殖作用，ALODA下调使肿瘤增殖受到明显抑制，因此ALDOA可能是CTNNB1突变亚型HCC患者的一个潜在治疗靶点[27]。Shimada等[12]的MS2亚型和Zhang等[16]的免疫缺陷亚型表现为免疫“冷”肿瘤，与Fujita等[18]的非炎性肿瘤亚型均可能是ICIs难治型；ICIs与溶瘤病毒(如JX-594)或肽(如LTX-315)的组合，可显著增强淋巴细胞浸润有望用于免疫缺陷亚型的HCC患者[28]。另外，Sia等[10]的免疫类、Kurebayashi等[13]的免疫高亚型、Zhang等[16]的免疫活性亚型和免疫抑制亚型都具有Lin等[29]所定义的反应型的特点，即具有强的免疫浸润和免疫检查点分子的富集，对ICIs有反应，受JAK/STAT3、WNT/TGF-β途径的调控，通过靶向这些途径来调节TIME可能是对抗耐药性的有效方法。以上亚型对免疫治疗的潜在意义虽需要进一步验证，但将分子免疫学特征与临床结局结合已成为基础和临床研究的重点。

3 小结与展望

HCC免疫治疗取得的进展使得人们更加重视TIME，基于TIME特点定义的分子分型可根据各自特有的分子特征和信号通路精确选择ICIs高应答率患者，有望提高HCC临床疗效和改善生存状况，且分型中发现的驱动基因将作为新的预测标志物和靶点被开发利用，为治疗决策提供参考。尽管在HCC中建立了多种分子分型，但由于同一种分型的不同亚型存在变量因素多，且不同技术平台存在质控差异，至今未有统一的、成熟的TIME分子分型，未来需要付出更多的努力将其转化为临床实践，以优化临床分期系统，促进HCC精准医学的发展。