菝葜皂苷元对结直肠癌细胞HT-29凋亡和自噬的影响

吴源陶，邹译娴，张春虎，王理槐

〔摘要〕 目的 探讨菝葜皂苷元（sarsasapogenin， SAR）对人结直肠癌细胞HT-29增殖、凋亡和自噬的影响。方法 将HT-29细胞分为对照组（DMEM培养液）和SAR组（DMEM培养液+DMSO+10、20、30、40、50、60 mg/L SAR溶液）;分别采用MTT法、流式细胞术、TUNEL染色及MDC染色检测细胞的增殖、凋亡及自噬的变化情况;用Western blot法检测细胞中Caspase-3、Caspase-9、Beclin-1及LC3B蛋白表达水平。结果 经SAR处理后，HT-29细胞的增殖能力明显降低（P<0.05），凋亡和自噬水平明显增加（P<0.05）;与对照组相比，SAR组细胞Caspase-3、Caspase-9、Beclin-1及LC3B蛋白表达水平显著上调（P<0.05）。结论 SAR能够抑制结直肠癌细胞增殖，诱导细胞凋亡和细胞自噬的发生，其机制可能与上调Caspase-3、Caspase-9、Beclin-1及LC3B蛋白表达水平有关。

〔关键词〕 菝葜皂苷元;结肠癌;大肠癌;细胞增殖;细胞凋亡;细胞自噬

〔中图分类号〕R273       〔文献标志码〕A        〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.11.001

Effect of Sarsasapogenin on Apoptosis and Autophagy of Colorectal Cancer Lines HT-29

WU Yuantao1， ZOU Yixian1， ZHANG Chunhu2， WANG Lihuai1*

（1. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chines Medicine， Changsha， Hunan 410007， China;

2. Xiangya Hospital， Central South University， Changsha， Hunan 410008， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the effect of sarsasapogenin （SAR） on the proliferation， apoptosis， and autophagy of human colorectal cancer cell HT-29. Methods HT-29 cells were divided into control group （DMEM medium） and SAR group （DMEM medium + DMSO + 10， 20， 30， 40， 50， 60 mg/L SAR solution）. MTT， flow cytometry， TUNEL staining， and MDC staining were used to detect the changes of cell proliferation， apoptosis and autophagy; Western blot method was used to detect the expression levels of Caspase-3， Caspase-9， Beclin-1 and LC3B protein. Results After treatment with SAR， the proliferation ability of HT-29 cells was significantly reduced （P<0.05）， and the level of apoptosis and autophagy increased significantly （P<0.05）. Compared with the control group， the expression levels of Caspase-3， Caspase-9， Beclin-1 and LC3B protein in SAR group were significantly increased （P<0.05）. Conclusion SAR can inhibit the proliferation of colorectal cancer cells， induce apoptosis and autophagy. The mechanism may be related to the up-regulation of Caspase-3， Caspase-9， Beclin-1 and LC3B protein expression levels.

〔Keywords〕 sarsasapogenin; colon cancer; colorectal cancer; cell proliferation; apoptosis; autophagy

結直肠癌（colorectal cancer， CRC）是常见的消化道恶性肿瘤之一，居全球恶性肿瘤发病率的第三位[1]。我国CRC的发病率和死亡率呈逐年升高趋势[2]。最新的调查数据显示，CRC在我国恶性肿瘤发病率中位列第三[3]。菝葜，又名金刚藤，为百合科植物菝葜Smilax china L.的干燥根茎，其主要成分是皂苷，且是以菝葜皂苷元（sarsasapogenin， SAR）为主要苷元所衍生的皂苷。研究[4]表明，SAR具有抗衰老、抗炎、降血糖等作用。近年来研究[5]报道，SAR还可用于抗肿瘤，如肝癌、胃癌等。但是，关于SAR对CRC的作用及其机制的研究报道甚少。因此，本研究拟以CRC细胞株HT-29为研究对象，通过观察菝葜提取物对CRC细胞株HT-29凋亡和自噬的影响，探讨菝葜提取物对CRC的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1  细胞株

人CRC细胞HT-29（批号：SCSP-5032）购于上海生物科学研究所，在含10%的胎牛血清的RPMI 1640培养液中培养，其内加入双抗，置于培养箱内常规培养。

1.2  试剂与仪器

SAR（海亿欣生物科技公司，批号：B20025）;DMEM培养基（批号：12491015）、胎牛血清（批号：10099-141-FBS）均购自美国GIBCO公司;二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）（美国Sigma公司，批号：67-68-5）;Caspase-3抗体（批号：9669）、Caspase-9抗体（批号：9504）、Beclin-1抗体（批号：3738）、LC3B抗体（批号：2775）均购自美国CST公司。

超净工作台（苏州净化公司，型号：SW-CJ-IFD）;二氧化碳培养箱（美国Thermo公司，型号：Shellab 2306）;流式细胞仪（美国Beckman-Coulter Inc公司，型号：Cytomics FC500）;全自动酶标仪（深圳迈瑞公司，型号：MR-96A）;实时定量 PCR 仪（美国 BioRad公司，型号：S1000）;离心机（美国Thermo公司，型号：Medifuge）;荧光显微镜（日本Olympus公司，型号：BX-51）。

1.3  细胞分组

将HT-29细胞以1×104个细胞/孔接种在96孔板培养24 h。分为对照组（DEME培养液）和SAR组（DMEM培养液+DMSO+10、20、30、40、50、60 mg/L SAR溶液），各组培养24 h后进行后续实验。

1.4  MTT法检测细胞增殖能力

取状态良好、生长旺盛的HT-29细胞，用胰酶消化细胞;以1×105/孔细胞密度接种至96孔板，常规培养4 h后分别加入10、20、30、40、50、60 mg/L的SAR，对照组不加药;药物处理24、48、72 h后，开始MTT反应，酶标仪490 nm检测OD值。根据OD值绘制细胞生长曲线。

1.5  流式细胞术测定细胞凋亡

将50 mg/L SAR加入细胞培养瓶中，培养48 h后，胰酶消化细胞，当细胞间隙变大、细胞变圆时，终止消化，依次以预冷的D-Hanks液及1×binding buffer洗涤细胞。离心重悬成细胞悬液。添加10 μL

Annexin V-APC染色液，应用流式细胞仪检测不同组别细胞的凋亡率。

1.6  MDC染色检测细胞自噬

取对数生长期的HT-29细胞，胰酶消化细胞，重悬成细胞悬液。加入50 mg/L SAR培养，2 h后加入6-OHDA，共培养48 h，对照组不加药，常规培养。后按照MDC染色试剂盒操作说明进行染色，荧光显微镜下观察，计数并拍照。检测到的高亮点状荧光代表自噬泡。

1.7  Western blot檢测蛋白表达量

用胰酶消化并收集处于对数生长期的HT-29细胞，加入SDS裂解液提取细胞总蛋白，后采用考马斯亮蓝法进行蛋白定量。取30 μg蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳分离蛋白，转膜至PVDF膜，封闭液室温封1 h;用TBST洗膜3次后，加入用TBST稀释的一抗（Caspase-3为1∶500;Caspase-9为1∶1 000;Beclin-1为1﹕1 000;LC3B为1∶1 000），4 ℃过夜;用TBST洗膜3次，每次5 min;经TBST漂洗后加入相应的二抗（1∶1 000），室温孵育2 h，TBST洗膜3次;加ECL显影剂，用自动凝胶成像分析仪检测，采用凝胶成像分析系统扫描分析。以β-actin为内参计算目的蛋白的表达水平。

1.8  统计学分析

采用SPSS 22.0统计软件对数据进行分析，所有数据用“x±s”表示。当数据符合正态分布时，组间比较采用one-way ANOVA分析。若方差齐，组间差异比较采用LSD法;若方差不齐，组间差异比较采用Tamhane法。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1  SAR对HT-29细胞生长抑制的影响

SAR能够抑制HT-29细胞的增殖，且对细胞增殖的抑制作用呈时间和浓度依赖性。与0 mg/L相比，用50 mg/L SAR干预48 h后，细胞增殖明显受到抑制（P<0.05）。因此选取50 mg/L SAR进行后续实验。见图1。

2.2  SAR对HT-29细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示，SAR组细胞早期凋亡率为3.24%，高于对照组细胞早期凋亡率的0.41%（P<0.05）;SAR组细胞晚期凋亡率为14.36%，高于对照组细胞晚期凋亡率的0.66%（P<0.05）。TUNEL染色结果显示，与对照组相比，SAR组TUNEL阳性细胞数明显增多（P<0.05）。见图2。

2.3  SAR对HT-29细胞凋亡相关蛋白的影响

与对照组相比，SAR组Caspase-3和Caspase-9蛋白表达上调（P<0.05）。见图3。

2.4  SAR对HT-29细胞自噬的影响

与对照组相比，SAR组可见到明显的自噬囊泡形成。见图4。

2.5  SAR对HT-29细胞自噬相关蛋白的影响

与对照组相比，SAR组细胞Beclin-1和LC3B蛋白表达增多（P<0.05）。见图5。

3 讨论

據世界卫生组织统计，CRC已成为全球第四大致命癌症[6]。根据中国国家癌症中心发布的《2018年国家癌症报告》显示，CRC在中国癌症发病率中排名第三[3]。因此，迫切需要寻找一种有效治疗CRC的临床药物[7]。SAR可通过多种途径发挥抗肿瘤作用，且由于其较高的安全性，使SAR的抗CRC癌活性已成为国内外研究的热点之一[5]。

凋亡是细胞为清除体内异常或受损细胞自发启动的程序性保护机制，在细胞发育和代谢中起着至关重要的作用[8-9]。临床上通过外部干预诱导肿瘤细胞凋亡成为治疗肿瘤的重要途径。有学者探讨了SAR对肝癌细胞HepG2凋亡的影响，发现SAR能够诱导HepG2凋亡[9-10]。廖子君等[10-12]研究发现，SAR能够诱导胃癌细胞BGC-823凋亡，而不会影响健康细胞的生长，同时能够上调Bax蛋白、下调Bcl-2蛋白的表达水平。在本研究中，流式细胞术结果发现，与对照组相比，SAR组HT-29细胞凋亡率显著增加（P<0.05）。TUNEL染色结果同样提示SAR可以诱导人CRC HT-29细胞凋亡（P<0.05）。进一步对细胞凋亡相关蛋白进行测定发现，SAR干预可上调HT-29细胞中凋亡相关蛋白Caspase-3和Caspase-9的表达（P<0.05）。凌博凡等[13]研究发现，SAR干预人结肠癌LoVo细胞48 h后能够诱导该细胞凋亡，该效应发生的同时线粒体膜电位会出现下调改变，提示诱导凋亡的机制可能与线粒体通路的调控有关。

自噬是真核生物体细胞内重要的自我降解和再循环机制。生理状态下，自噬通过清除自身有害物质（老化及死亡的蛋白质和细胞器）而维持细胞内稳态，对机体细胞发挥着保护作用[14-15]。当自噬发生异常时，细胞内原有的稳态会被打破，而促进肿瘤发生与发展[16-17]。Beclin-1基因是自噬的特异性相关基因，由其编码的Beclin-1蛋白被认为是肿瘤抑制蛋白，能够调节自噬过程，其机制可能是与ClassⅢPI3K相结合参与自噬泡的形成[18]。LC3B作为细胞自噬的特异性蛋白，其含量与自噬小体数量呈正相关，因而被广泛运用于自噬研究[19-20]。本研究运用MDC染色法研究SAR对细胞自噬的影响，结果显示，与对照组相比，SAR组可见到明显的自噬囊泡，且经SAR处理的HT-29细胞中，自噬相关蛋白Beclin-1和LC3B显著增多（P<0.05），提示SAR可激活HT-29细胞的自噬。

综上所述，SAR可能通过调控Caspase-3、Caspase-9、Beclin-1及LC3B蛋白的表达水平发挥抑制HT-29细胞增殖，诱导细胞凋亡和自噬的作用。但是其具体深层机制需后续实验进一步进行研究。本研究为菝葜皂苷的进一步开发和为CRC的临床治疗提供了有力的实验证据。

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（本文編辑  匡静之 周  旦）