基于香气物质进行乌龙茶核心种质构建与遗传评估

孔祥瑞，杨 军，林梓溪，马定国，王让剑*，陈常颂*

(1.福建省农业科学院茶叶研究所，福建 福州 350013；2.国家茶叶质量安全工程技术研究中心，福建 安溪 362441；3.福安市碧海蓝天农业科技发展有限公司，福建 福安 355000)

核心种质作为种质资源少而精的缩影性群体，是遗传理论研究和育种亲本选配的重要基础[1]。因此，核心种质构建长期以来始终是植物育种研究的热点和焦点[2-3]。以水稻、小麦、玉米、大豆、棉花、油菜等为代表的大宗作物[4-8]和以樟木、木荷等为代表的木本经济作物[9-11]，都取得了一系列突破性进展。同时，在取样策略、评价指数、分析流程等方面积累了很多值得借鉴的技术[12-18]。

茶树作为南方山区的重要经济作物，核心种质构建也有相关文献可供查阅[19-25]，但专门针对乌龙茶的核心种质构建的研究却鲜有报道。从上个世纪五六十年代开始，乌龙茶育种研究方向正式确立[26,27]，经过近70年的发展，在品种和资源数量上有了很大的积累。截至目前，我国被收集保存的乌龙茶品种和名贵单枞总数80余个，占我国茶树品种总数20%以上[28]。Lin等[29]研究发现，乌龙茶品种群体内具有较高的遗传多样性。不断增长的资源(含品种)数量和丰富的遗传多样性，为开展乌龙茶核心种质构建提供了客观条件。

乌龙茶有别于其他茶类最显著的特征是具有自然优雅的花果香，本研究选择铁观音、黄棪、茗科1号(金观音)等12个在生产应用上综合性状表现优异，极具高香特征的乌龙茶品种，以挥发性香气物质为表型性状，尝试构建乌龙茶核心种质筛选技术流程，并结合SSR标记，对筛选前后2个种群的遗传多样性进行比较分析，从而全面评价整套分析流程的可行性。以期为乌龙茶核心种质筛选评价和乌龙茶杂交育种亲本选配提供理论与技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选择福建省福安市碧海蓝天农业科技发展有限公司福安基地的12个茶树品种(种质)为试验材料(表1)，均为3龄期无性系植株，田间管理属同一立地条件随机区组种植。2020年10月，以一芽三叶为标准，用液氮取样，每个品种设3次实验重复。

表1 12个供试品种(种质)基本情况

1.2 香气组分测定

样品预处理参照李丽霞等[30]的方法，取1.0 g冷冻干燥样，加入3.2 g NaCl和5 mL 60℃超纯水，加盖密封后在60℃条件下水浴10 min，再经固相微萃取50 min和进样口230℃高温解析共5 min，-20℃密封保存、待测。

色谱条件：美国Agilent公司DB-5(3 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱箱：40℃；进样口温度：230℃；载气：氦气；采用不分流进样；流速：1.0 mL·min-1。升温程序：先40℃保持2 min，以5℃·min-1升温至85℃保持2 min，再以2℃·min-1升温至110℃保持2 min，最后以7℃·min-1升温至220℃保持8 min，总分析时间为123.5 min。

质谱条件：EI电离能量：70 eV；扫描范围为质荷比(m/z)35～400；离子源温度：230℃。

香气物质的定性与定量：对获得的挥发性成分总离子色谱图，通过检索mainlib、replib和nist_ri谱库完成定性；依据峰面积归一化进行定量。并与相关文献研究结果比较[31-33]，完成最终确认。

1.3 核心种质构建

核心种质构建通过QGAStation实现[34]，抽样比率设置为0.25，抽样方法选多次聚类随机取样法，遗传距离选马氏距离。

1.4 遗传多样性分析

DNA提取和SSR分析参考王让剑等[35]的方法。群体间遗传距离及遗传多样性指数等通过软件Powermarker计算[36]，其中基因型bp转0、1数据通过软件DataFormater完成[37]。个体遗传结构组成分析由R语言LEA软件包实现[38]，其他相关数据统计分析及图表绘制也均由R语言的ggplot2、export等包完成[39]。

2 结果与分析

2.1 香气组分的GC-MS分析

经SPME-GC-MS获得香气组分之后，在控制同一香气物质在不同品种间的保留时间≤0.1 min的条件下，可分离鉴定出的香气主要成分见表2。

表2 12个乌龙茶品种GC-MS分离主要香气成分相对含量

2.2 核心香气组分筛选

因为核心种质的分析过程需要构建非等长矩阵，即性状值必须少于品种数，所以，对上述30个香气物质进行核心成分筛选分析，通过软件QGAStation，将抽样比率设置为0.25，在多次随机抽样之后，根据核心香气成分与原总香气成分2个种群之间的差异统计分析，在均值未达到差异显著性水平和极差、变异系数变化趋势一致的情况下，获得橙花叔醇、芳樟醇、香叶醇等7个香气成分，初步将其作为典型表型性状供核心种质筛选使用，差异统计分析结果见表3。

表3 核心香气成分与原香气成分之间差异分析结果

2.3 核心种质构建

在筛选获得核心香气组分的条件下，同样使用软件QGAStation，将抽样比率设置为0.25，以多次聚类随机取样法进行乌龙茶核心种质筛选，其中遗传距离选用马氏距离。结果表明，基于核心香气组分，12个供试品种中可以筛选获得3个核心种质，分别是金牡丹、铁观音和悦茗香。这3个品种构建的核心种质与包括12个品种的原种质种群相比，在各个核心香气组分表型上的差异统计分析见表4。核心种质与原始种质之间，除芳樟醇氧化物I的方差呈现P<0.05显著差异之外，其他所有性状的均值、方差差异百分率都为0，即无显著性差异。此外，核心种质与原始种质间在7个核心香气表型上的极差和变异系数高度对应，极差符合率为67.97，变异系数变化率为105.27，综合多个统计参数，证明筛选出的核心种质对供试群体具有较好的表征力。

表4 核心种质与原种质间表型差异

2.4 核心种质遗传评估

2.4.1 遗传多样性分析 为了进一步考察整个核心种质构建流程的可靠性，本研究对所有参试品种进行了40对SSR引物的基因型分型分析，在12份供试材料上共检测到161个多态性位点，涉及200个等位变异，平均等位变异数为4.03，多态性信息含量(PIC)均值为0.50，说明这40对引物适合揭示该群体的遗传多样性。通过计算遗传多样性指数，发现核心种质种群的多样性指数变幅为0.08～0.77，可以完全涵盖原始群体的均值0.55水平，且2个种群间的遗传距离为0.133，从而在遗传水平上进一步证实了核心种质具有很好的群体表征力。

2.4.2 遗传背景分析 借鉴群体遗传学中常用的群体结构分析，采用LEA软件包的Structure功能来深入考察核心种质个体遗传背景的代表性，参照Evanno等的方法[40]，在K值等于3时，ΔK出现最大值拐点，因此将该供试群体暂定分为3个亚群来绘制Structure图。结果显示(图1)，金牡丹、铁观音和悦茗香在个体遗传组成上具有高水平的亚群代表性，更进一步证实了这3份材料被筛选成为核心种质的合理性。

图1 12份乌龙茶品种的群体结构图

3 讨论与结论

3.1 核心种质构建分析流程

核心种质构建作为动植物资源育种的核心研究内容，从最初的单纯依照表型筛选，到现在的多组学联合分析，呈现出了解析力度大、精度高的发展趋势，同时也对相应抽样策略和评估算法提出了更高的要求。本研究采用的抽样和评估方法均为当前的主流算法，根据分析结果来看，在以代谢物作为表型，应用多次聚类随机取样法可以满足乌龙茶核心种质筛选需求，并通过标记基因型解析方法辅以验证，进一步保证了分析结果的正确率。理论上，该分析流程也应该能够满足以其他表型值为目标性状的筛选需求。故此，稳健的乌龙茶核心种质构建分析流程可由极具扩展度的表型值、取样算法和遗传评估组成(图2)。

图2 乌龙茶核心种质筛选分析流程

3.2 小样本抽样表型值的取舍

在高通量测试技术不断发展的前提下，试验数据的性状观察值多于供试材料样本数的情况十分常见，使得很多算法因无法构建合理矩阵而限制其应用，通常的做法是应用主成分分析、均值聚类等各种算法进行数据降维，之后再用降维后的观测值来做后续分析。这类处理方法需要耗费大量的计算资源，而且实验效果也无从保证。本实验尝试应用原始数据倒置的处理方法，对性状值进行降维处理，分析结果与预期是完全吻合的。当将这些筛选出的核心性状在核心种质与原生种质2个种群进行小样本非参数差异统计检验时，7个表型在2个种群间无显著性差异，且P值0.39～1(图3)，从而逆向证明了倒置处理针对小样本进行表型值取舍的可行性。更肯定了该分析流程也可以应用于小样本群体的核心种质构建。

图3 非参数统计分析在2个种群间的差异检验结果

此外，通过该流程分析获得的核心表型值与宛晓春等[41]提到的乌龙茶香气物质主要成分相一致，即橙花叔醇对应木香，芳樟醇及其氧化物对应铃兰的清爽性花香，香叶醇对应蔷薇的温暖性花香。所以，今后相关研究可以将这7个香气成分作为乌龙茶呈香重要指标加以利用。理论上，选出的3个核心种质可以作为乌龙茶品种香气改良的优选亲本加以使用，但由于测试材料数量有限，3个核心种质的实际育种价值还有待深入研究。

就试验结果来看，这套技术流程完全可以满足乌龙茶核心种质构建分析，而且对表型值有较为宽泛的涵盖域。此外，对于小样本高通量表型数据也有相应的解决策略，使其在实际应用中具有更大的灵活性。再加上高通量测序技术的不断发展和大范围普及，该流程的基于遗传信息验证功能也将使整个分析流程具有更高的稳健性和纠错率，能够多层面确保筛选获得的核心种质具有较高的表征力。