DNS法测定茶叶中掺杂蔗糖含量

张珣，王婧，丁华，刘姣，杨洁，周有祥

（湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/农产品营养品质与安全湖北省重点实验室，武汉 430064）

茶因其独特的风味和保健功能而广泛被人们所喜爱［1］。但有些茶叶存在嫩度差、外形疏松的问题，有些厂家在茶叶的制作过程中添加一定量的蔗糖，来达到固定茶叶外形、调节茶叶颜色、提高茶的甘甜，同时增加茶叶重量的目的。商家在茶叶中添加蔗糖不仅欺骗消费者，破坏茶叶市场次序［2］，而且使茶叶更易滋生细菌，带来安全隐患［3］。建立可靠的外源蔗糖检测方法显得很有必要，目前文献报道茶叶中外源蔗糖的检测方法主要有高效液相色谱法［3，4］、液质联用法［5，6］、近红外无损检测［7］、薄层色谱法［8］、酶法［9］、离子交换色谱［10］。高效液相色谱法具有灵敏、高效、稳定的优点，但需配有特定的检测器，常用的有蒸发光散射检测器［11-13］和示差检测器［14］，此外还有脉冲安培检测器［15］。液相色谱-质谱联用法具有灵敏度高、选择性好、测定快速准确的优点。近红外无损检测是在对收集的红外光谱进行预处理和降维分析后，建立相应的模型，实现红茶中外源蔗糖含量的判别和含糖量的在线实时检测，该方法具有成本低、方便快捷的优点。薄层色谱法一般用于单糖的定性或半定量检测；酶法检测是基于某些单糖的酶促反应，例如蔗糖的水解、葡萄糖和果糖的磷酸化，根据酶促反应，测定样品中葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、总多糖的浓度，该方法已被商品化，结果稳定，操作简单，但效率低。离子交换色谱用于茶叶可溶性糖分析的检测器多为安培检测器，灵敏高效，但对样品的前处理要求高。此外还有气相色谱质谱联用法［16］和毛细管电泳法［17］等。在上述方法中，除商品化的酶法检测外，许多方法都有特定的仪器要求，不便于户外或及时检测，酶法检测成本较高。

DNS比色法测蔗糖含量的原理为蔗糖等双糖在酸性条件下经加热处理水解成还原糖。还原糖和过量的3，5-二硝基水杨酸在碱性环境下加热，将3，5-二硝基水杨酸还原成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸（图1）。在一定的浓度范围内，还原糖的浓度与溶液棕色程度成正比，用分光光度计测定其吸光度，可得到线性方程，从而可以对还原糖进行定量分析［18］。

图1 DNS法测还原糖原理

本研究在DNS法测还原糖的基础上以及在果蔬中已有相同原理标准执行的前提下，提出DNS法测茶叶中的蔗糖，具备一定现实基础。初步建立了检测茶叶中掺加蔗糖的方法，在有一定数据基础上能很好鉴别出添加了外源蔗糖的茶叶，同时对设备要求不高，方便随时随地检测，为茶叶外源蔗糖的检测提供了新的思路。

1 材料与方法

1.1 仪器

SIGMA3K15型离心机，SHZ-82A型水浴锅，HITACHI U-3900型紫外可见分光光度计，AL204电子分析天平，IKA A11研磨机。

1.2 方法

1.2.1 溶液的制备

1）3，5 -二硝基水杨酸（DNS）试剂。将6.3 g DNS和262 mL 2 mol/L氢氧化钠溶液加入到含185 g酒石酸钾钠（C4H4O6KNa·4H2O）的500 mL热水中，再加5 g苯酚和5 g亚硫酸钠（Na2SO3），搅拌使其冷却，用水定容至1 000 mL，贮于棕色瓶中备用。

2）1 mg/mL葡萄糖标准溶液。准确称取0.100 0 g经80℃干燥2 h的葡萄糖（C6H12O6）标准物质，溶解定容至100 mL，现配现用。

3）亚铁氢化钾溶液。称取10.6 g亚铁氢化钾［K4Fe（CN）6·3H2O］去离子水溶解定容至100 mL。

4）乙酸锌溶液。称取21.9 g乙酸锌［Zn（OAc）2·2H2O］，用少量去离子水溶解后加入3 mL冰乙酸，用去离子水定容至100 mL。

5）6 mol/L盐酸溶液。在500 mL烧杯中加入100 mL去离子水，量取100 mL盐酸缓缓加入烧杯中，边加边搅拌，混匀后装入储液瓶备用。

1.2.2 标准曲线的绘制 用移液管分别准确吸取0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2 mL葡萄糖标准溶液于6支10 mL具塞刻度试管中，加去离子水使溶液体积补至2.0 mL，加入4.00 mL 3，5-二硝基水杨酸试剂，置沸水浴中加热5 min。取出，立即置冷水中，冷却至室温，定容，摇匀。所得系列葡萄糖标准溶液浓度分别为0、0.02、0.04、0.08、0.10、0.12 mg/mL。用分光光度计测定540 nm吸光度。以葡萄糖浓度（mg/mL）为横坐标（x），吸光度为纵坐标（y），绘制标准曲线。

1.2.3 还原糖的测定 取1 mL待测样品于10 mL比色管中，补水至2 mL，加入4 mL DNS试剂，沸水浴5 min，定容至10 mL，540 nm下测吸光度，对照标准曲线计算还原糖含量。

1.2.4 淋洗与浸泡测茶叶蔗糖方法的比较 茶叶中若掺杂蔗糖，有2种基本的方法可以将内部蔗糖溶解出来，即淋洗法和浸泡法。为比较淋洗法和浸泡法对蔗糖的提取能力，取掺杂蔗糖茶叶样品，设计如下试验。

1）淋洗茶叶茶汤的蔗糖含量测定。①还原糖的测定：取5 g左右预先处理（加糖或不加糖）的一批茶叶流水淋洗10 s，取滤液，加入乙酸锌和亚铁氰化钾除去蛋白质，定容至100 mL，过滤，取滤液按“1.2.3”方法测还原糖含量，每个样品3个平行。②蔗糖的测定：取上述滤液50 mL，加入5 mL盐酸，68℃水浴振荡15 min，测还原糖量［19］。计算2次还原糖量之差，计算转化糖含量，从而得出蔗糖含量，每个样品3个平行。

2）浸泡茶叶茶汤中蔗糖含量的测定。①还原糖的测定：取5 g左右预先加糖处理的茶叶加入50 mL的去离子水，置于45℃水浴锅中，振荡浸提1 h，取茶汤，3 000 r/min离心3 min。过滤茶汤，定容至100 mL，适当稀释后用于还原糖测定，每个样品3个平行。②蔗糖的测定：上述茶汤定容后剩余的50 mL茶汤，加入5 mL的6 mol/L盐酸，68℃水浴振荡15 min，测还原糖量，计算2次还原糖之差，利用差值计算蔗糖含量，每个样品3个平行。

1.2.5 方法检出限与回收率试验 取3份已知蔗糖含量的茶叶样品，分别按每5.00 g茶叶向其中添加1、10、50 mg蔗糖，粉碎搅拌均匀，按浸泡茶叶测茶汤中蔗糖含量，每份测量3次，得到检出限计算回收率。

1.2.6 精密度试验 同时取5份相同样品按浸泡茶叶测茶汤中蔗糖含量，并计算标准偏差RSD。

1.2.7 样品的检测与分析 根据工厂添加蔗糖方式，选取在茶叶揉捻时分别添加不同质量蔗糖，在50 kg鲜叶中分别添加1、2、3 kg蔗糖，制备最终添加蔗糖含量分别为9.3%、18.5%、22.1%的样品，以不添加蔗糖样品为对照，测4份样品中蔗糖含量。同时取市场上16份茶叶样品，测蔗糖含量，比较差异，分析可能添加蔗糖种类。

2 结果与分析

2.1 绘制标准曲线

葡萄糖的质量浓度在0～0.12 mg/mL与其吸光度呈良好的线性关系，线性回归方程为y=16.04x-0.02，相关系数r为0.996（图2）。

图2 葡萄糖标准曲线

2.2 淋洗茶叶测得蔗糖含量

茶叶样品在经过短暂的流水淋洗后，表面的蔗糖部分溶于水中，在茶叶前处理上能节约时间。茶叶为已知样品，由表1可以看出，2号和5号样品蔗糖含量少，1号、3号、4号蔗糖含量多，为添加蔗糖样品。试验结果与实际蔗糖添加情况相符，在茶叶本身蔗糖含量相差不大的情况下能有效区分额外添加蔗糖的茶叶样品。

表1 淋洗茶蔗糖含量

2.3 浸泡茶叶测得蔗糖含量

由表2可以看出，相较于淋洗茶汤，浸泡茶汤的蔗糖含量整体提高，说明大部分蔗糖没有被淋洗下来。但结果同样表明，2号和5号茶叶蔗糖含量低，1号、3号、4号含量高，与预期相符。考虑到不同茶叶的溶解速度不一样，经相同的淋洗过程，自身或添加蔗糖被淋洗的情况会有所不同。综合考虑，淋洗操作节省时间和资源，但试验结果受茶叶本身影响更大，可以作为初步定性的参考；浸泡茶叶需要时间长，测得更准确，能满足定量的需要，后续将对浸泡法进行相关研究。

表2 浸泡茶蔗糖含量

2.4 方法检出限与回收率

试验以文献［18］的方法为基础，DNS方法的检出限为2.0 mg/L，线性范围为0～120.0 mg/L。由于茶叶成分复杂，通过试验确定蔗糖的检出限较为可信，分别添加1、10和50 mg的蔗糖。结果如表3所示，当添加量为1 mg时，测量误差大于测量值，在实际操作中无法反映出正确结果；当添加蔗糖为10 mg时，回收率117.60%，结果较为可靠，方法对添加蔗糖的检出限为2 mg/L。

表3 检出限与回收率

添加1 mg蔗糖，方法回收率低，相对偏差高，无法区分是否添加蔗糖，在添加蔗糖10 mg时，回收率较好，但RSD为9.18%，较大的相对偏差显示检测数据存在较大波动，原因是检测方法存在一定误差，当检测值较小时，相对偏差就大。当添加量为50 mg时，RSD明显减小。整体上当外源蔗糖添加量为10 mg时，该方法已经能准确定量检测。

2.5 精密度试验

取5份茶叶样品各5.00 g浸泡并检测，试验结果见表4。由表4可知，DNS法的精密度好，以茶叶中蔗糖（可溶性糖折算而来）为检测对象，该方法的RSD为2.47%。

表4 精密度试验结果

2.6 样品的检测与分析

在对市场上的16份茶叶样品（编号为1～16）检测后发现，不同茶叶蔗糖含量存在一定差异。一些茶叶蔗糖含量计算得到负值，是由于茶叶本身蔗糖含量低，测量存在一定误差。样品经多次检测仍为负值，说明是系统误差所致。分析茶叶样品数据可知这些茶叶蔗糖含量在0～21.29 mg/g（表5）。揉捻过程添加蔗糖的3份样品（编号为18～20，17号为对照）测得蔗糖含量分别为44.99、112.66、141.50 mg/g，计算回收率分别为48.4%、60.9%、64.0%。

表5 样品检测结果

经调查研究，要达到收缩茶叶外形和提升茶叶光泽度的目的，鲜叶的加糖量通常在5%左右。有文献报道在5%～25%［12］。其中5%的蔗糖添加至鲜叶中，折算成干叶其添加蔗糖量在9.26%左右，DNS法测得结果为44.99 mg/g，说明检测结果在44.99 mg/g以上，则可能为添加蔗糖样品，这一结论与陈琦等［2］的研究结果一致。

3 讨论

研究建立了茶叶中蔗糖的DNS测定方法，并运用在实际的样品检测中。能明显区分添加量为2 mg/g的蔗糖样品，实现定量检测，酸解3，5-二硝基水杨酸法在食品糖类检测中应用广泛，方法成熟，但食品基质成分复杂，茶叶中尤为明显，本研究开拓了其在茶叶蔗糖检测中的应用。但同时方法存在一定局限，主要表现在以下方面。同几乎所有测茶叶外源糖的方法一样，方法测定的是茶叶总的含糖量，对于是否添加蔗糖作出的是可能性的判断，不同茶叶本底影响不同，要给出合理的判断值需要更多的数据支持；方法前处理比较复杂，有待精简。淋洗法在添加蔗糖量较大时，可以粗略地测定区分样品，优点在于节省提取时间，样液基质更为简单，缺点是方法灵敏度不够。

DNS法在直接测还原糖含量时，相比酸解后再测还原糖结果的稳定性更好，有些茶叶蔗糖含量出现负值，可能是酸解操作给试验带来干扰。

在2次添加回收试验中，得到不同的回收率，一次在成品茶叶添加蔗糖，一次在茶叶制作过程中添加蔗糖，后者回收率较前者低，部分原因在于揉捻可使蔗糖渗入茶叶内部，增加提取难度。本方法在前处理上缺少优化试验，如水浴时间、料液比、提取介质、提取次数等，但鉴于试验结果已满足预期，不再进行优化试验。