生物3D打印用丝素蛋白基凝胶墨水的研究进展

姜雨淋， 王 卉， 张克勤

(1. 苏州大学 纺织与服装工程学院， 江苏 苏州 215021； 2. 苏州大学 现代丝绸国家工程实验室，江苏 苏州 215123； 3. 苏州大学 纺织行业丝绸功能材料与技术重点实验室， 江苏 苏州 215123)

蚕丝纤维因其柔软的手感、珍珠般的光泽及良好的吸湿性,在传统纺织领域使用已超过4 000年[1]。由于在蚕体内的自然成形过程中丝蛋白形成了准有序的液晶相，在后续吐丝过程中丝蛋白形成有序和无序相间结构，使蚕丝纤维表现出出色的力学性能，如强度、韧性。此外，蚕丝与生物体相互作用良好，产生免疫反应的概率极低，已被用作手术缝合材料近百年[2]。蚕丝纤维在传统纺织领域可以通过机织、针织和非织造等工艺制作成面料，而近年来蚕丝经脱胶工艺去除表面丝胶蛋白成分后所获得的再生丝素蛋白溶液，为制造具有多种形态结构的丝素蛋白(SF)材料提供了新的路径。然而，受到传统制造技术的限制，再生丝素蛋白材料的形态结构比较有限，难以呈现与天然组织类似的复杂精妙的多尺度、多层级结构，因此对调控细胞行为以及再生结构和功能化的组织作用有限，限制了其在生物医学领域的进一步应用。

3D打印技术是一种新兴的快速成形技术，相比于传统的制造方法，3D打印技术可精确快速地制造任意复杂形状的三维结构体，真正意义上地实现“自由制造”[3]。3D打印技术的独特优势使其在生物医疗领域发展迅速，可实现在体外重建具有特殊复杂三维结构和功能的类组织生物体系，为组织工程、再生医学、器官移植、药物筛选以及肿瘤研究等带来新的研究思路与解决方案[4]。然而目前阻碍3D打印技术应用于生物医学领域的一大挑战是研究开发适用的生物墨水。SF由于其优异的生物相容性、可调节的生物降解性、卓越的可加工性以及成熟的养蚕行业可提供充足原料等优点而被广泛用作生物材料，这为生物3D打印提供了一种可能的新型生物墨水[1,5]。

本文主要总结了SF材料的基本特性，探讨了其作为生物墨水材料的要求和可加工性，综述了近年来SF水凝胶墨水材料在生物3D打印领域中的研究进展，并对其所面临的挑战以及未来的发展前景进行了讨论。

1 SF在生物3D打印领域的发展

生物3D打印技术自诞生以来就备受关注，该技术以活细胞、细胞因子和生物材料为原料打印活体组织，在再生医学研究领域表现出巨大的应用前景[6]。1988年，KLEBE[7]最早提出采用喷墨打印机将细胞精确定位，以构建二维和三维结构体，这项工作为生物3D打印技术奠定了初步基础。随后生物3D打印技术蓬勃发展，2005年，YAN等[8]开发了挤出式生物3D打印技术以构建细胞生物材料复合三维结构体。之后，随着第1台商业用生物3D打印机的上市，该技术逐渐成熟，开始了选择合适生物墨水材料进行3D打印的探究。

采用生物3D打印制造，打印方法和生物墨水材料是2个基本的关键要素,对打印结构体的强度、形状和打印分辨率等因素的控制，主要取决于3D打印制造方法。打印所用的生物墨水作为生物3D打印的核心之一，是生物3D打印产品成功的关键。打印所用的生物墨水可以分成含细胞和不含细胞2种；生物打印也相应的有2种策略：一种是先打印出支架再接种种子细胞的间接打印;另外一种是支架材料和种子细胞一起打印的直接打印。在生物墨水的选择上，具有高含水量和形状可塑性的水凝胶由于具有与天然组织相类似的微环境，适合包裹细胞进行生物3D打印，被广泛应用于生物墨水材料。SF作为一种已被广泛认可的生物材料，因其所具备的天然成凝胶特性成为了具有吸引力的生物墨水候选者。2015年，研究者成功制备了SF基生物墨水，随后进行了墨水的层级打印、软组织重建等尝试[9-12]。最近塔夫茨大学研究团队通过生物3D打印技术打印了一种兼具促血管和神经支配的SF/羟基磷灰石支架[13]。前期研究表明,基于SF的生物墨水在生物3D打印技术中展现出巨大的研究和应用价值;然而加载活细胞、生长因子和生物功能性物质的生物墨水仍处于生物3D打印研究的早期阶段,因此，迫切需要进一步探索基于SF作为打印墨水的要求和可打印性。

2 SF的结构与重要特性

家蚕是SF材料的主要来源，家蚕吐出的桑蚕丝中主要包括SF和丝胶蛋白，此外还有少量的蜡质、色素和无机物等杂质[14]。SF是一种具有半结晶结构的纤维蛋白，这种结构为其提供了一定的刚度和强度。丝胶是一种胶状的水溶性的蛋白质，作为胶黏剂保持纤维的结构完整性，通过碱性脱胶法可去除[15]。SF占蚕丝总质量的70%～75%，目前一致认为它是由分子质量约为26 ku的轻链和分子质量约为390 ku的重链通过二硫键结合，并以非共价键方式与糖蛋白P25连接在一起[16]。重链、轻链和P25的分子比例为6∶6∶1。SF结晶区和非晶区中的二级结构主要为无规卷曲、α-螺旋、β-转角和β-折叠，它们的形成与SF的一级氨基酸序列直接相关。家蚕SF包含45.9%的甘氨酸(Gly)、30.3%的丙氨酸(Ala)、12.1%的丝氨酸(Ser)、5.3%的络氨酸(Tyr)等多种氨基酸[17]。SF重链的疏水区域包含一个高度重复的六肽氨基酸序列(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser)，构成了反平行的β-折叠结构并形成大部分结晶区域。重复性较低的六肽氨基酸序列(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Tyr)构成β-转角并形成半结晶区域。蚕丝的结构如图1[18-20]所示，丝胶包裹在2束平行的SF纤维表面，将它们绑定在一起。各种研究表明，反平行的β-折叠纳米晶体通过提供刚性有序的交联域来显著提高蚕丝的力学强度，而由β-转角、α-螺旋和无规卷曲结构组成的半无定形基质在结晶域之间提供弹性和物理联系。轻链上的氨基酸序列是不重复的，所以轻链更加亲水并且相对有弹性[1,18]。

图1 桑蚕丝的多层次结构Fig.1 Multi-level structure of mulberry silk. (a)Schematic diagram of multi-level structure of single mulberry silk; (b)Scanning electron microscope images of natural mulberry silk; (c)Schematic diagram of amino acid sequence in SF crystal region

由于SF特定的化学组成和结构，使其展示出良好的生物相容性，为SF材料应用于生物3D打印提供了可能。1995年，MINOURA等[21]首次评估了SF的生物相容性，发现其对细胞的粘附和生长作用同胶原蛋白一样。更多的研究表明脱胶的SF纤维没有明显的巨噬细胞活化行为，证明了其较低的潜在炎症和免疫原性，SF材料可适用于进行体内移植和细胞培养[22-23]。迄今为止，SF生物材料因其较好的生物相容性、低免疫原性和较好的力学强度等特点使其在生物医学领域中发挥着重要的作用[24]。

根据常规的溴化锂溶解方案，天然桑蚕丝通过脱胶、溶解、透析和纯化后可获得再生SF溶液。通常，再生SF溶液是以一种亚稳定状态形式存在，即在无任何外界处理的情况下，SF溶液也会随着时间的推移向SF凝胶转变，但是自然凝胶过程相对比较缓慢，所需时间可长达数月[25]。由于SF的肽链中含有丰富的极性氨基酸，而这些极性氨基酸的侧基又含有活性较强的基团，因此，很容易通过化学或物理交联方法促使SF的β-折叠聚集体的形成或纤维蛋白分子的交联形成水凝胶，包括机械搅拌、超声波处理、温度调控、离子交联或生物酶交联、pH值调节和有机溶剂调节等(见图2[26])。SF水凝胶优异的生物特性使其适合包裹细胞进行生物3D打印，并可应用于软骨、皮肤、血管和骨组织修复等生物医学领域。此外，SF来源丰富、易于制造或加工，且所形成的水凝胶具有可调节的生物降解性，同时还具有无免疫原性，即材料在植入后不会引发先天或适应性免疫反应[27]。这些特点使得SF凝胶成为了生物3D打印理想的生物墨水材料来源。然而，由于较低的浓度和黏度，未经加工的SF水凝胶无法直接应用于生物3D打印制造，需要改善其可打印性和生物功能。

图2 SF水凝胶的交联方式及其3D打印结构体在组织工程领域的应用Fig. 2 Crosslinking of SF hydrogels and application of 3D-printed structures in tissue engineering

3 生物3D打印对生物墨水的要求

在生物3D打印过程中，对生物墨水最基本的要求是具有良好的可打印性，而且还必须具备合适的交联机制来完成所需结构体成形(形状保真度)，并且需要能够保护细胞在打印过程中免受压力作用，保持较高的细胞活性，如图3[28]所示。决定水凝胶生物墨水可打印性的主要物理化学参数是其流变特性和交联机制。同时特定的打印参数，如喷嘴规格会决定嵌入细胞所承受的剪切应力，打印时间也会影响嵌入细胞的活力。最后，一旦水凝胶前体被打印出来并且细胞存活下来，打印的构建体必须拥有或可被赋予形状保真度和足够的机械稳定性。此外，在使用具有不同溶胀行为的生物墨水时，还必须考虑水凝胶的膨胀或收缩特性。面对生物3D打印中对生物墨水的苛刻要求，开发用于生物制造的水凝胶系统，即适用于3D打印和细胞培养的水凝胶生物墨水仍然是一个挑战。

图3 水凝胶生物墨水在生物3D打印中至关重要的影响因素及其相互关系示意图Fig.3 Schematic diagram of the critical influencing factors and their relationship of hydrogel bio-ink in biological 3D printing

这些对生物墨水的要求和不同的生物3D打印技术是相互关联的，并且是十分重要的。面对不同的生物打印技术，包括挤出式生物3D打印技术、光固化生物3D打印技术和喷墨生物3D打印技术，每种打印技术都基于不同的物理过程，这些过程定义了合适的生物墨水的标准[29]。

3.1 挤出式生物3D打印技术

挤出式生物3D打印技术具有灵活性好、打印速度快、易于操作等优点，是目前3D打印SF基水凝胶中最常用的一种技术[26]。该技术可以通过气动、活塞或者螺旋结构来分散生物墨水，这种技术的优点是能够输送的细胞和材料选择性广泛，并且能够分散具有高细胞密度的高黏性生物墨水[29]。此外，该技术打印的细胞具有较高的细胞活力，通常高于90%。但该技术的打印分辨率较低，其打印精度和可行性主要取决于水凝胶的流变性能和固化成形性能。对于挤出式生物3D打印而言，水凝胶墨水流变性能的研究和优化是极为重要的。由于单纯SF水凝胶较低的浓度和黏度，需要通过各种物理化学手段改善和优化其流变性能。在对墨水材料流变性能的研究中，通常可采用旋转流变仪来进行测试，常使用3种典型流动几何形状[30]，测试内容一般包括流动测试和振荡测试。其中流动扫描一般采用步阶速率，目的是获取流体的稳态流动曲线。水凝胶具有剪切变稀的特性是其可打印的关键，因为剪切变稀特性一方面可以保证水凝胶能够顺利被挤出，避免过多的流体剪切应力和高黏度堵塞的可能性；另一方面可以保证挤出的长丝保持其形状，提高打印稳定性并确保打印结构的精度。振荡测试一般包括振幅扫描和频率扫描等，振幅扫描的目的是确定水凝胶的线性黏弹区，频率扫描是检测水凝胶对频率的响应能力以及探测凝胶的结构信息。GHOSH等[31]于2008年使用浓缩的质量分数为28%～30%的丝素溶液作为墨水，并通过喷嘴处的甲醇溶液触发SF结构的转变，成功实现了SF基生物墨水的挤出式3D打印。

3.2 光固化生物3D打印技术

光固化生物3D打印是一种通过光激发、分层固化的3D打印技术，具有高分辨率、可实现复杂结构精细打印的特点[32]。该技术是基于紫外光光敏材料聚合物的原理，选择性地进行逐层固化液态光敏聚合物。这就要求水凝胶需同时具备2种特性：生物相容性和光敏特性。因为单纯的SF不能发生光聚合反应，所以一般会选择加入光引发剂，这样在打印过程中，可通过调控光强和曝光时间等打印参数来调节固化动力学。KIM等[32]首次合成了甲基丙烯酸缩水甘油酯改性SF，使SF通过曝光聚合，成功突破了SF与光固化生物3D打印技术不兼容的难题。

3.3 喷墨生物3D打印技术

喷墨3D打印也是生物3D打印中最常用的方法之一，因其特殊的工作过程，微滴化、高通量、非接触式和按需滴落是该技术的基本特征。它的原理就是在喷嘴处安装压电陶瓷或者微型的加热器，利用热量产生气泡将生物墨水从喷嘴喷出，从而形成液滴。液滴的大小可以通过改变打印条件来控制，如温度、黏度等[33]。应用于喷墨打印的墨水材料要求低黏度以避免堵塞喷头。此外，对于给定的喷嘴，墨水的表面张力也需要考虑，因为喷嘴的浸润性可能导致形成的是喷雾而不是形成墨滴的喷射，所以除了黏度之外，墨水的密度和表面张力可能会影响墨水的流动和液滴形成，也需要进行考虑。喷墨打印技术可以精确地将SF基水凝胶打印出多种多样的构造，具有产生图案化结构的能力。当然，在打印过程中也还存在液滴方向性不能精确控制，喷嘴易堵塞，打印出的几何形状不规则等问题[33]。2006年，LIMEM等[34]将水溶性丝素溶液打印到乙烯基塑料基片上，形成一系列具有梯度分离距离的平行线，将喷墨3D打印技术应用在打印SF结构体上。

4 SF基墨水的生物3D打印研究

SF具备良好的生物相容性、低免疫原性、可调的力学性能和充足的来源等特性，显示出其作为生物3D打印墨水的优势[35];但是由于再生SF溶液的低浓度和低黏度阻碍了其在生物3D打印的广泛应用[36],因此，研究者基于再生SF水溶液的物理化学特性，优化水凝胶的可打印性、力学性能和形状保真度等基本参数，从而使SF显示出强大的生物3D打印生命力[37]。目前通常通过采用加热和聚乙二醇溶液浓缩的手段来提高SF水溶液的浓度，或通过添加有机溶剂来满足生物墨水的流变性能要求。然而，在加热和浓缩过程会改变SF溶液的二级结构，有机溶剂的残留物也会对细胞活力产生不利影响。目前许多研究者采用通过掺混其他高黏度生物材料来获取良好流变性能的SF基生物墨水。这一方法大大改善了SF材料在生物3D打印中的应用。多组分生物墨水不仅可以保存单个组分的优点，且可以通过原料的筛选和配方的优化调控生物墨水一系列的物理、化学和生物学特征，从而改善其可打印性和生物功能性[38]。

4.1 复合人工合成聚合物的SF基生物墨水

合成聚合物种类丰富，虽然生物相容性较差，但其结构与性能可控，重复性较好。将SF与合成聚合物复合，合成聚合物中的大分子基团会影响SF的结构构象，致使通过一定物理或化学交联形成的复合水凝胶兼具天然SF优良的生物相容性与合成聚合物高弹性形变和强度等力学性能的优势[39]。

EGAWA等[40]将不同含量的SF与光固化树脂聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)混合制备形成复合生物墨水，通过光固化3D打印技术打印形成SF/PEGDMA复合水凝胶支架。研究结果表明,复合墨水中SF的含量可有效调控最终打印结构体的微孔结构、压缩强度和压缩模量。打印的水凝胶的弹性压缩模量具有广泛的可调范围，表明可通过控制SF的含量构建适用于不同组织特性的支架。KIM等[32]通过甲基丙烯酸酯取代SF的伯胺构建了一种SF基生物墨水(Sil-MA)，用于光固化生物3D打印技术。研究结果表明，Sil-MA水凝胶墨水具有出色的机械和流变特性，可构建高度复杂的器官结构，包括心脏、血管、大脑、气管和耳朵，具有优异的结构稳定性和可靠的生物相容性。LI等[41]开发了一种由聚己内酯(PCL)和SF组成的生物墨水，并通过挤出式3D打印技术构建了仿生复合组织工程半月板支架。实验结果表明，结合SF和PCL这2种组分的复合支架显示出优越的生物力学、结构和功能，能有效促使滑膜间充质干细胞(SMSC)增殖、分化和细胞外基质的产生，并能显著地增强半月板再生以及对软骨组织起到明显的保护作用。

4.2 复合天然聚合物的SF基生物墨水

天然聚合物材料具有优良的生物相容性、生物降解性和可吸收性等，将天然聚合物材料与SF复合，在一定程度上能够提高SF的力学性能和可打印性，同时能够更好地保留SF优良的生物特性。常见的与SF复合的天然聚合物主要有明胶、海藻酸盐、纤维蛋白、胶原、透明质酸钠、壳聚糖和脱细胞外基质等[39]。

LI等[42]将SF与胶原蛋白材料复合作为生物墨水，基于挤出式生物3D打印技术设计并成功构筑了模拟皮层脊髓束结构的胶原蛋白/丝素蛋白支架(3D-C/SF)。研究结果表明，与正常冷冻干燥技术形成的C/SF支架相比，通过3D打印技术可精确定义支架的微观和宏观结构并显著改善支架的功能特性，基于仿生结构设计的3D-C/SF植入物有助于脊髓带的重新定位并促进轴向连接，并且在适当时间内可达到良好的修复效果，有助于神经再生和运动功能的稳定恢复。KIM等[43]利用离子交联技术制备出海藻酸盐复合SF(Alg/SF)生物墨水，通过光固化3D打印技术制备三维结构。研究结果表明，与传统的Alg水凝胶相比，3D打印的Alg/SF支架表现出良好的细胞亲和力和尺寸稳定性。LEE等[44]以核黄素为光引发剂，通过在SF中加入明胶(gelatin)获得结构稳定的水凝胶墨水，SF/gelatin复合墨水良好的可打印性使其可通过光固化3D打印技术实现复合墨水的3D打印。

4.3 复合无机功能材料的SF基生物墨水

近年来，为了进一步提升SF基生物墨水的可打印性和功能性，研究者尝试将多种聚合物与SF复合，或者是加入功能性的无机材料，赋予SF基墨水更佳的打印分辨率、形状保真度和足够的力学稳定性，并且兼具多功能性，从而增加SF材料的应用前景。

SANGKERT等[45]通过海藻酸盐(Alg)、聚乙烯醇(PVA)结合SF开发仿生水凝胶墨水，利用3D打印技术打印形成支架。Alg可使3D打印支架具有良好的稳定性，PVA具有独特的粘附功能，SF中则含有一些能诱导新骨形成的氨基酸。将支架与成骨细胞一起培养，研究结果表明，SF的存在使打印的复合支架具有较低的溶胀性和较高的降解性，并且显示出良好的细胞粘附、活力和增殖以及良好的碱性磷酸酶活性、蛋白质合成和钙沉积，该SF基3D打印支架在颌面部手术中具有良好的应用前景。KADUMUDI等[46]利用单宁酸作为酚醛胶分子与SF、石墨烯和氯化钙共混，以制造无机-有机混合多组分水凝胶(CareGum)。借助热辅助挤出3D打印技术，CareGum可打印成各种复杂多层结构，包括螺旋、正方形、立方体、金字塔和圆柱体等。3D打印的CareGum支架结构坚固并具有弹性，足以支撑自身的质量，并且CareGum所具有的自愈性有助于非常快速地稳定打印层间结构，以形成最终的三维结构体。此外，CareGum多组分的巧妙搭配促使CareGum展现出多功能性，如高机械韧性、约25 000%的伸长能力、对任意和复杂表面的优异顺应性、在各种材料表面良好的粘附性和优异的导电性。CareGum作为一种具有前景的新型先进材料可广泛应用于3D打印、机器人、人机交互界面和柔性生物电子器件等领域。

5 结束语

SF水凝胶良好的生物相容性、可调的力学强度和降解性，近年来成为了生物墨水绝佳的候选材料，在生物3D打印中得到了高度的关注。尽管已经报道了许多可适用于不同3D打印技术的基于SF研发的生物墨水，但将这项技术真正应用于临床仍然需要在许多方面继续努力。

SF水凝胶的结构稳定性差、含水量和黏弹性高，这些缺点对精确打印高分辨率的仿生结构构成了重大挑战。在SF基生物墨水的设计和加工中，需要考虑一系列的物理、化学和生物学特征，特别是在其黏度、流变性、独立和适用的力学性能、生物降解性、生物相容性以及生理条件下的细胞装载和封装能力等方面。目前已报道的方法主要是通过调控SF的浓度或掺入其他材料，但是大多数方法为了获得高分辨率的打印结构体而加入一系列的化学试剂，一定程度上会破坏SF材料的绿色天然属性和生物相容性特征。这需要对这种生物墨水材料基本特性有更深入的理解，系统地理解特定流变特性对可打印性和形状保真度的作用，在SF基生物墨水3D打印的要求方面需建立系统的知识储备，为基于SF的生物墨水设计提供参考，以加速研发新型的生物墨水。

此外，不只是专注于优化SF基生物墨水设计，还可考虑修改打印环境以允许SF基水凝胶和细胞悬浮液的高形状保真度打印，如通过悬浮浴打印。同时，多种生物3D打印技术的联合使用，或者是新型打印技术的开发都会为SF 基生物墨水的3D打印制造提出新的技术解决方案。相信在未来，随着生物技术的发展，通过生物3D打印形成的SF基水凝胶构建体在生物医学领域会有更广阔的应用前景。

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