miRNA在卵巢早衰颗粒细胞中的研究进展

梁竞文 历 凯 孙丽英 张宇驰 葛鹏玲

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是40岁以前出现的闭经现象，表现为促性腺激素水平下降、月经不调、闭经、不育和围绝经期综合征，这种情况可能会对生殖、心理健康和生理健康产生不利影响，其与遗传因素、病毒感染、自身免疫性疾病、代谢性疾病、医源性损伤等有关[1，2]。患者出现围绝经期潮热盗汗、性欲减退、阴道干涩、失眠、月经减少、稀发，甚则不孕的一系列症状，同时伴随体内雌激素(estrogen，E2)降低，卵泡刺激素(follicule stimulating hormone，FSH)升高，黄体生成素(luteotropic hormone，LH)升高或不变[3]。现代医学认为POF的相关病因复杂，其发病机制尚不明确，因此探寻该病发病机制是目前研究的重点。在治疗方面，激素代替疗法(hormone replacement treatment，HRT)是使用较为广泛的方法，另外还有诱导排卵、卵巢移植或一些联合治疗等，研究表明HRT能预防骨质流失并促进心血管健康，但也有资料表明激素治疗中可能存在着一些不良反应，而且可能有增加卵巢癌或其他疾病的风险，这一点仍待考证[4，5]。

在卵巢中卵泡的发育过程是复杂的，它是由原始卵泡经过初级卵泡、次级卵泡及窦卵泡从而进一步发育成熟直至排卵或闭锁的[6]。由于颗粒细胞(granulosa cells，GCs)的凋亡导致了卵泡闭锁，因此GCs功能障碍也许会是POF可能的病理特征之一[7]。GCs的作用也引发了研究卵巢相关疾病的重要性，加之miRNA在组织发育和分化过程中起关键作用，近年来在探讨POF发病机制方面开始有学者聚焦于GCs中miRNA的研究，寻找可以调节POF中GCs功能障碍的miRNA也会为改善POF患者提供新的范例。故本文将对miRNA在POF颗粒细胞中的相关研究进展展开综述。

一、miRNA在卵巢中的作用

微小RNA(microRNA、miRNA)是一类小型非编码RNA，改变其表达水平关联多种病理状况。它们通过与靶基因3′UTR中的互补序列结合而引起mRNA变性或基因沉默，从而导致基因表达的转录抑制。 miRNA还可能控制了生殖内分泌功能，并在卵母细胞成熟和卵泡形成过程中发挥着重要的作用。在类固醇合成中，miRNA还与性腺体细胞、颗粒细胞的功能调节有关。据估计，miRNA可调节70%以上蛋白质编码基因的翻译，并参与增殖、分化、凋亡、发育等。在POF潜在的机制中，对蛋白质编码遗传因子的研究最为深入，然而，蛋白质编码基因的编码外显子在基因组中的占比非常少，所以基因组的非编码部分在之前的研究中已被认为是表观遗传调控因子，对人体的发育、生理和疾病有至关重要的作用。研究最多的非编码区类别的典型示例即是miRNA，并且miRNA在卵巢中的研究与探索逐渐增多，高通量与生物信息学等方法已找寻了大量相关的miRNAs，这也揭示了对卵巢基本功能存在的影响。研究揭示了几种miRNAs在不同物种卵巢中的表达，表明它们可能在卵巢功能中发挥重要作用。miR-23a、miR-27a、miR-22-3p、miR-146a、miR-196a、miR-290-295、miR-423和miR-608等都可能与POF有关。对哺乳动物卵巢中这些miRNA的靶基因进行生物信息学预测、筛选和基因本体论分析也可以确定生物学过程和途径或分子网络，包括细胞周期、细胞间信号转导、细胞生长增殖等。

miRNA在卵巢中作用的研究主要是通过Dicer进行的，Dicer是核糖核酸酶Ⅲ(RNase Ⅲ)家族成员，其能在RNA干扰(RNAi)途径中发挥作用，将长的双链RNA切割成小RNA，这其中就包括miRNA。当非编码序列由RNA聚合酶Ⅱ和RNase Ⅲ家族成员Drosha和Dicer处理时，会生成成熟的miRNA。Dicer对于卵母细胞的生长、发育以及对激素信号的响应是必不可少的[8]。Otsuka等[9]研究证明了由于亚型突变导致的Dicer表达减少以及由于卵巢血管生成缺陷和黄体功能不全而导致的不孕等现象。但Dicer作为miRNA生物发生所必需的进化保守的关键因素，在女性生殖系统中对GCs等的具体功能尚不清楚。因此，研究Dicer在GCs中的功能也许可以深入了解miRNA在GCs中的作用。

二、颗粒细胞(GCs)与卵巢早衰(POF)

由于POF的机制尚未查清，因此诸多学者致力于研究其机制及可能的延缓方法，其中值得注意的是原始卵泡的耗竭与成熟卵泡的质量,二者提示了POF可能的机制。在卵泡的发育过程中由于卵母细胞的增大，使得周围的颗粒细胞由原始卵泡中卵母细胞周围的一层立方状的颗粒细胞分裂成为多层立体状细胞层。由于从原始卵泡到成熟卵泡的转变涉及了GCs的分化和功能转化，因此，GCs与卵母细胞之间的相互作用对于协调卵母细胞的成熟至关重要。卵母细胞通过一些激活因子的分泌协调GCs的增殖和分化，GCs也为卵母细胞提供营养因子。另外，卵泡的闭锁主要是由GCs凋亡引起的，GCs还可以通过分泌AMH、FOXL2等调控原始卵泡的激活。因此，抑制颗粒细胞凋亡对于改善POF起着重要作用，在细胞凋亡中，Bcl-2家族与caspase家族的重要性是显著的，另外FAS通路与TNF通路等都可以介导凋亡，通过检测相关蛋白的作用对于疾病的研究也有重要的导向作用。

GCs中miRNA的表达可能对卵泡生成和卵巢类固醇生成中涉及的特定基因的表达具有直接的调节作用。研究表明，miRNA参与控制了卵巢类固醇P和E2的释放[10]。miRNA的表达差异可能解释了异常的卵泡发育，这也有助于鉴定与该表型有关的途径。

三、miRNAs在卵巢早衰(POF)中对颗粒细胞(GCs)调控作用的研究

1. miRNAs通过参与GCs激素途径调控POF:在卵巢中，激素水平的变化可以帮助判定病变情况，包括雌二醇(E2)、黄体激素(LH)、卵泡刺激素(FSH)等。有研究表明，卵巢中促卵泡激素受体(FSHR)仅在GCs中表达，这对于它们的增殖、生长、功能和分化至关重要。经过FSH处理可以诱导GCs中100多个基因的表达[11，12]。FSH诱导的TGF-β途径调控已在不同哺乳动物物种的GCs中得到证实，例如人和大鼠等。另一方面，TGF-β信号转导与叉头盒L2蛋白(FOXL2)共同调节FSHR，因而影响了卵泡中GCs正常增殖和分化等功能。在卵泡形成过程中，FOXL2与TGF-β超家族成员通过自分泌调节机制发挥了涉及细胞内FSHR转录和GCs增殖的双向调节作用，激活素A和生长分化因子9(growth differentiation factor 9，GDF9)等[13]。另外，在卵泡发育过程中，FSH还增强了GCs细胞中孕酮的产生。Yao等[14]证明了在FSH诱导的大鼠卵巢GCs孕激素分泌过程中，miR-29a和miR-30d显著下调，这表明它们可能对孕酮的合成有影响。FSH介导的作用除其他信号级联反应外，还通过3′，5′-单磷酸(cAMP)/蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)/cAMP反应元件结合蛋白途径完成。由此可见，miRNA可通过与GCs中的FSH途径相互作用来调节GCs增殖、激素分泌以及分化等。GCs中miRNA的表达也可能对卵泡生成和卵巢类固醇生成中涉及的特定基因的表达具有直接的调节作用。

FOXL2序列和哺乳动物表达的高度保守性提示了在卵巢发育和功能中可能的关键作用，FOXL2还参与了炎症、细胞凋亡、活性氧代谢等。叉头L2蛋白(FOXL2)在卵巢颗粒细胞中表达并通过转录调控靶基因来参与类固醇的发生，研究发现miRNA-133b可以通过靶向STAR和CYP19A1下调FOXL2在颗粒细胞中的表达并且促进了颗粒细胞中雌激素的合成，这为改善POF患者E2激素的下降提供了可能性。

除去促性腺激素、类固醇和其他多种生长因子之间的复杂相互作用外，卵泡的发育还应该受到来自不同细胞的不同信号的调控，GCs中分泌的激素也受到另外一些miRNA的影响，研究表明，miR-144通过抑制环氧合酶2的表达来抑制前列腺素E2，前列腺素E2是重要的卵泡内旁分泌调节剂，在排卵过程中具有特殊作用、miR-375介导促肾上腺皮质激素释放激素信号通路并抑制卵泡雌二醇合成、miR-96靶向Forkhead box蛋白O1(FOXO1)以诱导人GCs中类固醇的产生[15～17]。miR-378通过靶向猪GCs中的芳香化酶来调节卵巢雌二醇的产生。miR-320通过在卵泡发育过程中靶向E2F1和SF-1来调节类固醇的产生等。这些都在激素途径上起到相关的作用，后续研究也可以引起对这些miRNA的重视。

2.miRNAs通过颗粒细胞凋亡调控POF：在构建POF模型时，常用化学药物或放射性处理来建立，如4-乙烯基环己烯双环氧化物(4-vinylcyclohexene diepoxide,VCD)、环磷酰胺等，其中VCD可以特异性地加速小鼠和大鼠中原始卵泡和初级卵泡的闭锁，直至耗尽原始卵泡。另外，顺铂作为一种广泛使用的抗癌药物，其因过度激活原始卵泡的缘故也常被用来诱导POF模型[18]。实验发现从骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSC)中收集外泌体可能用于治疗顺铂诱导的POF小鼠模型。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是具有不同分化潜能的细胞亚群，是干细胞治疗领域的研究热点。干细胞具有自我更新和再生的潜力，干细胞疗法也被认为是潜在修复和恢复受损组织正常功能的潜在替代疗法，这也为POF的临床治疗提供了一种新方法。间充质干细胞(MSCs)由于其分离，培养和扩增的简便性，被认为是干细胞治疗中最有希望的接种细胞。研究显示，骨髓间充质干细胞可以修复脊髓、心肌和皮肤损伤[19]。研究表明，骨髓间充质干细胞可以有效恢复大鼠卵巢受损组织的结构和功能，并抑制GCs的凋亡[20]。研究发现，骨髓间充质干细胞可以减慢顺铂诱导的大鼠GCs凋亡。虽然BMSC的工作机制尚不明确，但有证据表明其衍生的外泌体中的miRNA可以影响颗粒细胞的增长，经检测，miR-664-5p被认为是BMSC衍生的外泌体中的主要RNA，miR-644-5p在BMSC衍生的外泌体中过度表达，并通过靶向p53影响卵巢颗粒细胞的功能，另外，p53、p65和TGF-β之间的转录合作还调节了鼠GCs中miRNA-224的转录，miR-224的异位表达通过靶向SMAD4刺激TGF-β1诱导了小鼠GCs增殖，目前虽尚未阐明p53在颗粒细胞凋亡中的作用，但这些也都在通路、凋亡相关蛋白和一些相关基因方面为POF的治疗提供了新的策略和方向。

近年来随着化学治疗剂的研发和应用，肿瘤患者的存活率不断提高。但相应地，由化学疗法诱发的POF的发生率也在增加[21]。目前，POF的治疗仍未得到有效的突破，也尚无彻底的疗法可以逆转化疗引起的卵巢结构和功能损害，miR-21作为哺乳动物中最早发现的miRNA之一，与许多细胞的凋亡调控有关，Fiedler等[22]在人绒毛膜促性腺激素处理之前和之后4h在小鼠颗粒细胞中鉴定出13种差异表达的miRNA。进一步的研究表明miR-21可以抑制小鼠排卵性颗粒细胞的凋亡。有研究还通过构建miR-21慢病毒载体转染MSC并与GCs共同培养，表明miR-21在MSC中的过表达增强了对化疗诱导的POF的疗效，其修复作用的改善可能与靶向PTEN和PDCD4抑制GCs凋亡有关。这为改善临床上化疗过程中可能引起的卵巢功能问题提供了靶向性依据并指明了方向。

半胱天冬酶级联是凋亡的重要途径，caspase-8和caspase-9的激活会启动细胞凋亡，这会导致凋亡的执行者caspase-3裂解并降解底物多聚ADP-核糖聚合酶[poly(adp-ribose)polymerase，PARP]。研究表明，miR-146a直接靶向IRAK1和TRAF6，通过半胱天冬酶级联反应促进了卵巢颗粒细胞的凋亡[23]。此外，胱天蛋白酶抑制剂对胱天蛋白酶级联的抑制作用可以减弱miR-146a对卵巢颗粒细胞凋亡的影响。以上的miRNA对颗粒细胞的凋亡均具有积极的促进作用。这些结果可能对POF的预防或治疗有很大用处，当然关于其深入的机制还有待于进一步研究。

四、展 望

miRNA作为一类小型非编码RNA，广泛的参与正常状态和患病状态[24]。单个miRNA可以抑制数百甚至数千个基因，并且单个基因也可以被多个miRNA调节[25]。现在的研究热点也开始聚焦于miRNA过表达或沉默及其与相关靶基因或信号通路之间的关系，以期寻找疾病可能的治疗手段。

关于POF，未来对miRNA在生理性和功能性排卵中作用的研究也会为不育和其他卵巢疾病提供新的诊断和治疗策略，由于颗粒细胞在POF机制中的重要性，系统地鉴定GCs特异的miRNA将有助于研究人员更好地了解与卵巢疾病有关的潜在机制。本文主要描述了miRNA在颗粒细胞中的作用，以及miRNA在GCs中表达的研究，并通过靶向特定分子调节各种信号转导途径(例如TGF-β、FSH、激素以及细胞凋亡相关途径等)直接调节卵巢卵泡的正常发育和功能[26]。许多有关GCs在正常卵巢发育中的功能以及生殖系统疾病，例如多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)和卵巢早衰的知识在很大程度上是通过临床研究和临床前动物模型获得的。因此通过这些模型和实验找寻大量相关的miRNA进行研究就尤为重要，对miRNA靶向性和作用机制的深入了解也将为正常GCs发育的机制以及这些具有不同GCs表型的疾病的病因和病理生理学研究提供有价值的见解。但尽管如此，调控POF期间miRNA的表达和单个miRNA在颗粒细胞凋亡中的功能的信号通路仍有待阐明。

实际上，miRNA对GCs凋亡的作用应分为两类：正调控的凋亡miRNA和负调控的凋亡miRNA。一方面，本文已主要说明了几种miRNA抑制GCs凋亡的机制，无论是通过靶向关键蛋白还是激素途径或影响凋亡信号通路等，都可以起到相应的作用。另一方面，也有miRNA作为了GCs凋亡的启动子，例如，miR-4110通过靶向SMAD2诱导GCs凋亡，miR-23a和miR-27a通过在Fas配体(FasL)-Fas信号转导途径中靶向SMAD5促进人GCs的凋亡等[27，28]。以上的miRNAs是否影响了对于卵巢早衰中GCs的调控作用，又是怎样进行的，这些还需要开展深入研究。

目前，对于各种miRNA的筛选及其作用机制的探讨还要更加深入和全面，作用的靶点也对治疗有很重要的意义。文中一些miRNA也许能作为POF的诊断、治疗或预后标志物，甚至在POF的治疗中具有了可能的治疗靶向性，但治疗性干预仍需要深入地了解miRNA在调节对卵巢激素的生殖反应中的作用。