基于网络药理学探讨芪莲益肾膏治疗慢性肾脏病的免疫调节机制

王彦芳 史宏硕 张颖颖 杨田田,2 司国民,2

1.山东中医药大学中医学院，山东济南 250355；2.山东省立医院中医科，山东济南 250021

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）是由多种原因导致的肾脏结构和功能异常[1]。其全球平均发病率为9.1%，我国患病总人数高达1.32 亿[2]。如何延缓CKD 进程一直是国内外研究的热点，具有重要价值和意义。

芪莲益肾膏（原名参芪解毒膏）是山东省立医院的院内制剂，其药物组成为黄芪、丹参、当归、酒大黄、芡实、墨旱莲、天葵子、白茅根、生牡蛎、仙灵脾、金樱子、白花蛇舌草、阿胶，具有补肾健脾、活血化瘀、化浊解毒之功，本课题组前期研究证实，该方可改善CKD患者肾脏功能、延缓CKD 进程[3]；芪莲益肾膏联合P311 可改善肾纤维化[4-7]。免疫细胞及细胞因子可促进纤维母细胞增生，促进肾间质纤维化形成[8]。芪莲益肾膏是否可通过下调促肾纤维化的免疫细胞的分化及细胞因子的产生而延缓CKD 进程，值得研究。

本研究基于网络药理学方法，筛选芪莲益肾膏治疗CKD 的核心靶标及免疫相关通路，建立“活性成分-靶点-通路”网络，并通过分子对接技术对结果进行初步验证，探究芪莲益肾膏治疗CKD 可能的免疫调节机制。

1 材料与方法

1.1 芪莲益肾膏活性成分的筛选

利用中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）[9]分别搜索芪莲益肾膏所含的13 味中药的主要化学成分。

1.2 药物靶点与疾病靶点的预测筛选

利用TCMSP、DrugBank（https：//www.drugbank.ca/）[10]数据库查找药物有效成分的作用靶点，UniProt 数据库（https：//www.uniprot.org/）[11]标准化靶点信息，物种选“Homo sapiens”，得到芪莲益肾膏的作用靶点。同时，分别以“chronic renal failure”“chronic kidney diseases”“Renal Insufficiency，Chronic”为检索词，利用DrugBank、TTD（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）[11]、CTD（http：//ctdbase.org/）[11]（Inference Score ≥50%）、GeneCards（https：//www.genecards.org/）[11]（Relevance score≥50%）数据库筛选CKD 的相关靶点。利用在线维恩图[9]取药物靶点和疾病的靶点的交集，即为芪莲益肾膏作用于CKD 的相关靶点。

1.3 芪莲益肾膏活性成分-靶点网络图的构建

将芪莲益肾膏的活性成分与对应靶点导入Cytoscape 3.2.1 软件[10]，成分或靶点用节点表示，成分和靶点间的关联用边表示，得到芪莲益肾膏活性成分-靶点网络图，并利用Network analyzer 功能对网络中的拓扑属性进行分析。

1.4 GO 生物过程和KEGG 信号通路富集分析

将芪莲益肾膏活性成分作用于CKD 的相关靶点，通过DAVID 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）[12-13]进行GO 生物过程分析，选中3 个子类，分别为细胞组分（cellular component，CC）、生物过程（biological process，BP）和分子功能（molecular function，MF），并利用Cytoscape 3.2.1 中的ClueGo 插件对KEGG 信号通路富集分析，筛选可能与治疗CKD 相关的免疫调节通路，构建靶点-通路网络，将此网络与“1.3”构建的成分-靶点网络合并，获得成分-靶点-通路网络。

1.5 分子对接

利用Uniprot PDB 数据库查找主要信号通路相关蛋白的PDB 格式，将mol2 格式的治疗CKD 的芪莲益肾膏的主要化学成分导入LeDock[14]进行分子对接。

2 结果

2.1 芪莲益肾膏活性成分的筛选

截至2020 年12 月，初步检索到黄芪87 种，丹参202 种，当归125 种，大黄92 种，芡实26 种，墨旱莲48 种，天葵子84 种，白茅根33 种，淫羊藿130 种，金樱子48 种，白花蛇舌草37 种，未检索到生牡蛎和阿胶的化学成分。利用口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，类药性（drug likeness，DL）≥0.18 为条件筛选，共得到芪莲益肾膏的有效成分144 种。各药间的共同成分（共10 种）见表1。

表1 芪莲益肾膏各药间的共同成分信息

2.2 芪莲益肾膏活性成分治疗CKD 相关靶点的筛选

检索到芪莲益肾膏144 种有效成分的2082 个靶点，去除各成分间的共同靶点，共得到261 个成分相关靶点。筛选出313 个CKD 相关靶点。二者交集得到的83 个靶点，即为芪莲益肾膏活性成分治疗CKD 的相关靶点。见图1。

图1 芪莲益肾膏靶点与慢性肾脏病靶点维恩图

2.3 芪莲益肾膏活性成分-靶点网络分析

将药物活性成分和作用于CKD 的相关靶点构建成分-靶点网络图（图2）。菱形代表活性成分，共109 个，圆形代表靶点，共83 个。靶点数较多的前三位化学成分分别是槲皮苷（quercetin）、木樨草素（luteolin）、山柰酚（kaempferol），靶点数分别为68、31、27，其可能是芪莲益肾膏治疗CKD 的关键化学成分。

图2 芪莲益肾膏有效成分-靶点网络图

2.4 GO 生物过程和KEGG 信号通路富集分析

以P ＜0.01 为筛选条件，富集在CC 的条目为11 个，BP 的条目为73 个，MF 的条目为12 个，按P 值升序，靶点所富集的这3 个子类中的前10 个条目见图3。

图3 芪莲益肾膏治疗慢性肾脏病靶点GO 生物过程富集分析

KEGG 信号通路富集分析图见图4。筛选出P ＜0.01 的通路91 条，与免疫调节相关的通路主要包括IL-17、TNF、Th17 细胞分化、NF-κB、JAKSTAT 等。通过Cytoscape 软件构建芪莲益肾膏治疗CKD 免疫调节相关的成分-靶点-通路网络图（图5）。芪莲益肾膏中有102 种活性成分作用于39 个靶点，通过IL-17、TNF、Th17 细胞分化、NF-κB、JAK-STAT等免疫相关通路发挥作用。

图5 芪莲益肾膏治疗慢性肾脏病成分-靶点-通路网络图

2.5 分子对接

根据KEGG 分析结果，笔者推测调节Th17/Treg平衡可能是芪莲益肾膏治疗CKD 的机制之一。Th17和Treg 的主要转录因子分别为RORγt 和Foxp3。将mol2 格式的3 种主要活性成分（槲皮素、木樨草素、山柰酚）和PDB 形 式的2 种重要靶点（RORγt 和Foxp3）导入LeDock 进行分子对接。结果显示，这三种活性成分和这两种转录因子的结合能均小于零，提示活性成分可以自发地与转录因子结合，发挥生物学作用（表2）。对接示意图见图6。

图6 主要活性成分与Foxp3、RORγt 对接示意图

表2 主要活性成分与Foxp3、RORγt 的结合能（kcal/mol）

3 讨论

肾脏病的发病及病程进展与免疫功能紊乱密切相关[15]，炎症及微炎症状态是造成免疫功能失调的基础[16]。微炎症[17]是免疫性炎症，与炎症因子的表达有关。已有学者[18-23]研究证实，CKD 患者体内存在微炎症，IL-17 水平升高，通过下调炎症因子的表达，如CRP、IL-6、TNF-α，可有效延缓CKD 患者肾纤维化进展。在T 细胞诱导的炎症反应中，IL-17 是炎症细胞网络中的早期启动因子，Th17/Treg 比例失衡是微炎症的主要机制之一[24]。Th17、Treg 分化分别受IL-6/JAK2/STAT3/RORγt、IL-2/JAK3/STAT5/Foxp3调控[25-27]。Th17 细胞可分泌IL-17，IL-17 可诱导IL-6、TNF-α 等炎症细胞因子的表达，引起局部炎症细胞的浸润及组织损伤。IL-17 与IL-17R 结合，可活化接头分子TRAF6，通过NF-κB 通路发挥生物学作用。

综上，芪莲益肾膏可通过免疫调节作用延缓CKD进展，发挥作用的主要成分可能是檞皮素、木犀草素、山柰酚等，涉及到的关键通路有IL-17、TNF、Th17 细胞分化、NF-κB、JAK-STAT 通路，对Th17/Treg 平衡的调节可能是其作用机制之一。但具体而深入的作用机制还需进一步实验阐明。