固相萃取 液相色谱-质谱法测定地表水中喹诺酮类抗生素

付晓燕，刘莲莲

(辽宁省大连生态环境监测中心，辽宁 大连 116023)

1 引言

喹诺酮类(4-quinolones)，又称吡酮酸类或吡啶酮酸类，是人工合成的含4-喹诺酮基本结构的抗菌药。喹诺酮类以细菌的脱氧核糖核酸(DNA)为靶，妨碍DNA回旋酶，进一步造成细菌DNA的不可逆损害，达到抗菌效果。喹诺酮类是应用比较广泛的一类抗生素药物，被广泛应用于养殖业中。喹诺酮类药物在动物机体组织中的残留，人类食用动物组织后，喹诺酮类抗生素就在人体内残留蓄积，极易造成人体疾病对该药物的耐药性，影响人体疾病的治疗。一旦释放进入环境中，便会分布到水、土壤和空气中，产生一系列代谢及降解产物，而这些产物往往具有更大的毒性。由于喹诺酮类药物具有强极性及在环境样品中含量低的特点，导致对其分析检测难度增加[2,3]。

检测水环境中残留抗生素，分析方法灵敏、准确、快速是其环境行为和生态效应研究的必要手段。传统的微生物检测方法是利用抗菌药物敏感的菌株作为指示生物体，再根据最低抑菌浓度推算出提取液中的药物浓度，但是该方法十分繁琐。高效液相色谱-紫外检测方法的选择性不强，对于某些抗生素灵敏度不高，不能快速准确分析。液相色谱-串联质谱法具有选择性强、灵敏度高、简便快速和应用范围广等特点，成为当前水环境中检测痕量抗生素残留方法的发展趋势。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

ACQUITY UPLC 液相色谱仪，Waters TQ Detector 新型离子源加热型质谱仪；色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm, 1.7μm )；ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 mm×50 mm, 1.8 μm )；：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm, 1.7μm )；Milli-Q超纯水器；固相萃取柱：填料为二乙烯苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物；0.22 μm有机相针筒式微孔滤膜过滤器，材质为玻璃纤维、亲水性聚丙烯、亲水性聚四氟乙烯(PTFE)等。

甲醇为HPLC级(美国J. T. Baker公司)；甲酸为HPLC级(美国Sigma公司)；实验用水为经Milli-Q净化系统制备的超纯水(经0.22 μm过滤膜)；氮气、氩气(纯度≥ 99.999%)；其他试剂均为分析纯；磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑及磺胺甲基嘧啶-13C6标准物质：纯度均≥99%(百灵威公司)；

2.2 色谱条件

ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm )，流动相为甲醇-0.1% 的甲酸水溶液 。时间分别为：0、0.5、5.0、7.0、7.5、8.5、9.0、10.0 min，甲醇浓度分别为：5%、5%、30%、30%、90%、90%、5%、5%，甲醛水溶液浓度分别为：95%、95%、70%、70%、10%、10%、95%、95%。流速0.2 mL/min，柱温40 ℃，进样量10 μL。

2.3 质谱条件

电离方式为电喷雾电离ESI( + )，检测方式为多反应监测(Multiple Reaction Monitor, MRM)方式，利用保留时间和碎片信号比值判断定性结果；电喷雾电压3 kV；离子源温度120 ℃；去溶剂温度350 ℃。

2.4 样品制备

准确移取100 mL水样，用0.45 μm滤膜过滤，HLB固相萃取柱进行萃取。萃取柱应先进行活化，活化方法为：分别用10 mL 甲醇、10 mL超纯水活化HLB 萃取柱。水样以小于5 mL/min的流速通过固相萃取柱，完成后用10 mL超纯水淋洗小柱，再用氮气吹干小柱，最后用10 mL甲醇洗脱富集固相萃取柱，并用接收管接收甲醇洗脱液，氮吹浓缩至近干，加甲酸溶液定容到1.0 mL，最后加入内标使用液10.0 μL，经0.22 μm滤膜过滤，置于进样瓶中，等待进样。

3 结果与讨论

3.1 滤膜的选择

由于选择的色谱柱填料粒径为1.7 μm比较小，因此选择了0.22 μm的四种不同材质滤膜作比较：玻璃纤维、尼龙、亲水性PTFE和聚丙烯滤膜，使用针式过滤器过滤，对空白加标样品进行分析，5种喹诺酮类抗生素加标浓度为10 μg/L，发现滤膜样品通过率为57%～98%，按照通过率高低顺序，选择通过率大于90%的0.22 μm的玻璃纤维滤膜、亲水性聚丙烯滤膜、亲水性PTFE滤膜。

3.2 液相色谱条件的优化

喹诺酮类抗生素分子具有较强的极性，在大部分反相色谱柱上,即使以纯水作流动相，依然只有很弱的保留[5]，因此选择合适的色谱柱对喹诺酮类抗生素的分析测定至关重要，本研究分别比较了ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm )、ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm )和ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(2.1 mm×50 mm,1.8 μm)两种类型的色谱柱对目标化合物的分离效果。结果表明ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm )色谱柱对目标物具有最佳的色谱分离效果，且在10 min内目标物完全分离。

流动相的组成不仅影响目标化合物的色谱峰形和分离效果，还会影响其离子化效率和质谱检测灵敏度。本研究考察了不同比例有机相(30%、50%及60%) 的分离效果，最终确认甲醇-水(30∶70，V/V)为主要洗脱梯度，含0.1%的甲酸体系，具有最佳的电离效果和质谱特征。

3.3 质谱条件的优化

根据喹诺酮类抗生素的分子结构的特征和化学电离性质，实验选择了ESI(+)作为离子化模式。为了获得最佳的灵敏度和分离效果，首先，采用连续直接进样，扫描范围为m/z 10～300，分别对电喷雾电压、离子源温度、去溶剂温度、锥孔气流量、锥孔电压，碰撞电压等条件进行优化，使调谐液中喹诺酮类抗生素的离子化效率达到最佳。

4 结论

本方法建立了液相色谱-串联四级杆质谱联用仪，对水中喹诺酮类抗生素分析快速，着重研究了液相色谱-串联四级杆质谱联用仪对水中喹诺酮类抗生素的快速测定。该方法通过固相萃取法进样分析，节省了水样前处理过程中需要消耗的大量有机溶剂及衍生试剂，并缩短了检测时间，方法检测限低至0.015 μg/L，是一种分析速度快、定性准确、灵敏度高、稳定性好的分析方法[10，11]。