miR-503和钙黏蛋白在食管癌中表达及与患者预后的关系*

王军岐 贾 永 申骏龙 骆 晴

食管癌是一种全球范围内常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在全球致病性病因中位居前列。近年来，数据显示每年大约有50万例患者死于食管癌，约占消化系统恶性肿瘤死亡总数的1/4，严重危害人类健康[1]。该病确诊患者的病情多数为癌症晚期，目前的治疗手段较为局限，且预后较差。为提高食管癌患者的预后生存率，医学领域应大力开展与食管癌的发生、发展有关基因的分子靶点治疗研究，实现早期诊断。miRNA可调节多种生物学过程，每一个miRNA都具有多个靶基因，miRNA调控着人类约1/3的基因。已有研究表明，miR-503在不同肿瘤中呈现出多样化作用，如miR-503在肝细胞癌[2]、结直肠癌[3]、子宫内膜癌中表达下调[4]，而在甲状旁腺肿瘤[5]、视网膜母细胞瘤[6]中表达上调，但其在食管癌中的研究较少。钙黏蛋白(E-cadherin)即上皮型钙黏蛋白，属于钙黏蛋白家族中的经典钙黏亚族，主要分布于上皮细胞表面，是形成细胞间黏附连接、维持细胞极性和组织完整性的主要分子。有诸多研究结果显示，E-cadherin能有效抑制肿瘤细胞的增殖和转移，被认为是一种肿瘤抑制因子[7]。且有研究发现[8]，miR-503-3p在乳腺癌组织和血浆中高表达，可通过直接靶向E-cadherin促进乳腺癌上皮间质转化。本研究将检测miR-503、E-cadherin在食管癌中的表达，并初步分析二者与食管癌患者预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2013-09—2015-03在宝鸡市中心医院胸外科接受外科手术治疗的食管癌患者119例作为研究对象，并收集术中切除的食管癌组织和癌旁正常组织。

纳入标准：(1)符合食管癌诊断标准[9]；(2)首次确诊并行食管癌根治术；(3)临床资料完整；(4)对本研究内容知情，自愿参加本次试验。排除标准：(1)术前行新辅助治疗；(2)伴感染或合并自身免疫性疾病；(3)失访和无术前白蛋白记录者。本研究获得本院伦理委员会批准后实施，所有研究对象或家属签署知情同意书，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2 主要试剂与仪器

山羊抗兔单克隆抗体(批号：20120526)、免疫组化SP染色试剂盒(批号：20111204X)、DAB显色试剂盒(批号：20130415)购自碧云天生物科技有限公司；苏木素染色液(批号：20120819)购自北京索莱宝科技有限公司；RNA提取试剂盒(批号：20110921)购自于北京天根生化有限公司；miScript SYBR?Green qPCR Kit(批号：20121023)购自德国QIAGEN公司；U6引物购自abcam公司；其它引物由上海生工生物公司设计合成。实时荧光定量PCR仪(型号：CFX96)购自美国Bio-Rad公司。病理组织脱水机(型号：TP1020)、石蜡包埋机(型号：EG1150)、石蜡切片机(型号：RM2235)购自德国Leica公司。

1.3 主要研究方法

1.3.1 免疫组化法检测食管组织中E-cadherin表达：癌组织和癌旁正常组织切片经二甲苯和递减酒精梯度脱蜡、水化后，采用0.01M枸橼酸钠缓冲液(pH为6.0)于微波炉中进行高温抗原修复30min；冷却后加入3%过氧化氢以灭活组织内源性过氧化物酶，室温孵育10min；洗涤后加入1%牛血清白蛋白，室温下封闭30min；弃去封闭液后将稀释好的一抗滴加至组织切片上，4℃孵育过夜；洗涤后加入二抗37℃环境下孵育35min，加入辣根过氧化物酶，经DAB显色、苏木素复染；递增酒精浓度梯度溶液脱水、二甲苯溶液透明后，采用中性树脂封片，于倒置显微镜下进行镜检并拍照。一抗均按1∶100稀释，二抗为1∶800。结果判定：采用双盲法，由两位资深病理科医师观察每张切片后作出判定。根据免疫组化显色情况进行评分，无色计为0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分；按阳性细胞百分比计分：阴性计为0分，1%—10%计1分，11%—50%计2分，51%—75%计3分，>75%计4分。用染色强度得分和阳性细胞数得分的乘积作为该样本中E-cadherin表达积分，将积分≥3分设为E-cadherin表达阳性[10]。

1.3.2 实时荧光定量PCR法检测组织中miR-503的相对表达量：取冻存癌组织和癌旁正常组织，进行超声匀浆，严格按照RNA提取试剂盒提供的说明书进行提取组织中总RNA，在260、280nm处分别测定RNA溶液吸光度(A)值，测算RNA溶液的浓度和纯度，选取A260/A280结果在1.8—2.0之间者进行实验。然后逆转录反应：逆转录反应总体积为20μl，反应条件：37℃ 60min，95℃ 5min。将合成的cDNA放置在-20℃冰箱保存备用。最后采用实时荧光定量PCR仪对miR-503进行扩增：反应体系共10μl：miScript SYBR®Green Mix 5μl，cDNA(50ng/μl)1μl，上下游引物(10μM)各0.5μl，ddH2O 3.0μl。反应条件：95℃ 90s；95℃ 30s；63℃ 30s；72℃ 15s；40个循环。以U6为内参，采用2-ΔΔCt法表示miR-503相对表达量。miR-503及内参引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

1.4 随访

所有患者均通过门诊定期复查或电话随访，随访开始于治疗结束后，每6个月随访一次，随访时间截止于2020-03，无失访病例。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 食管组织中E-cadherin表达积分和阳性表达率

与癌旁正常组织比较，食管癌组织中E-cadherin阳性表达率、表达积分均显著降低(P<0.01)。见表2。

表2 食管组织中E-cadherin表达情况比较

2.2 食管组织中miR-503相对表达量

与癌旁正常组织比较，食管癌组织中miR-503相对表达量显著上升(P<0.01)。见表3。

表3 食管组织中miR-503相对表达量比较

2.3 不同病理特征食管癌组织中miR-503表达水平和E-cadherin表达积分

食管癌组织中miR-503、E-cadherin表达与患者性别、年龄无关(P>0.05)；与浸润深度T1+T2、TNM分期Ⅰ+Ⅱ、高分化、无淋巴结转移比较，浸润深度T3+T4、TNM分期Ⅲ+Ⅳ、中和低分化、有淋巴结转移的患者miR-503相对表达量显著上升，而E-cadherin表达积分显著降低(P<0.01)。见表4。

表4 不同病理特征食管癌组织中miR-503、E-cadherin的表达

2.4 食管癌组织中miR-503表达与E-cadherin表达积分的相关性

Pearson法分析显示，食管癌组织中miR-503表达与E-cadherin表达积分呈负相关(r=-0.517，P<0.01)。

2.5 miR-503、E-cadherin表达与食管癌患者预后的关系

以食管癌组织中miR-503相对表达量的平均值(1.37)为界分为miR-503高表达(≥1.37，78例)和miR-503低表达(<1.37，41例)，以食管癌组织中E-cadherin表达积分的平均值(4.11分)为界分为E-cadherin高表达(≥4.11分，49例)和E-cadherin低表达(<4.11分，70例)。采用Kaplan-Meier法分析结果显示，食管癌组织中miR-503高表达者5年累积生存率(42.31%，33/78)低于miR-503低表达者(65.85%，27/41)(χ2=4.962，P<0.05)；食管癌组织中E-cadherin高表达者5年累积生存率(79.59%，39/49)高于E-cadherin低表达者(30.00%，21/70)(χ2=25.803，P<0.01)。见图1、图2。

图1 不同miR-503表达水平患者5年生存率比较

图2 不同E-cadherin表达积分患者5年生存率比较

3 讨 论

食管癌是肿瘤引起死亡的常见疾病，居世界癌症死因顺位的第6位，全球每年约有45.6万食管癌新发病例和40万死亡病例，而我国食管癌发病率和死亡率均较高。同时，有研究者对食管癌近20年的发展做出预测，截至2040年，世界食管癌发病人数及死亡人数预计上升至91.33万人，约是目前数据的1.7倍[11]。由于食管癌缺乏有效的临床诊断方法，常在发病后期被诊断，目前手术、放疗和化疗是其典型治疗方法，但治疗效果与患者预后均不佳。

已证实miRNA可通过调节细胞分化、细胞增殖和细胞凋亡作为癌基因或肿瘤抑制因子。其中，miR-503异常表达与许多疾病包括癌症有关。miR-503通过自身序列碱基配对形式与靶基因mRNA的3'端非翻译区形成完全或不完全互补，导致靶基因mRNA的降解或者翻译抑制，进而达到调控肿瘤发生、发展的目的[12]。据此，推断miR-503在食管癌中表达量的变化可能作为临床病理表现一个重要标志物。本研究结果显示与癌旁正常组织相比，miR-503在食管癌组织中高表达，与Liu等[13]的研究结果相一致。通过分析食管癌组织中miR-503相对表达量与一般临床资料的相关性，结果发现miR-503在食管癌组织中表达与浸润深度、分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关；Wu等[14]也发现，与未患病食管组织比较，食管癌组织中miR-503表达水平呈上调趋势，进一步研究分析发现miR-503表达水平与淋巴结转移、TNM分期、肿瘤分化程度呈负相关。由此推测miR-503或可作为食管癌早期诊断的标志物。

Cadherin为钙黏附蛋白家族的成员之一，是一种细胞骨架黏蛋白[15]。E-cadherin的表达减少或丢失与肿瘤临床病理表现存在一定关系，已有研究者检测到食管癌患者的外周血标本中也存在E-cadherin等基因的高甲基化，并证实进行相关基因的甲基化检测，与传统的血清学标记物相似，可用来筛选和监测食管癌[16]。然而，E-cadherin蛋白表达对食管癌预后的影响仍存在争议。王江陵等[17]对食管鳞癌患者的研究结果发现，在食管鳞癌组织中E-cadherin表达量低于癌旁组织中的表达量。本研究通过采用免疫组化法检测食管癌患者组织中E-cadherin表达水平，结果显示E-cadherin在食管癌组织中的阳性表达率、表达积分与癌旁正常组织相比相对较低，与上述结果相一致。本研究通过分析食管癌组织中E-cadherin表达积分与一般临床资料的相关性，结果发现E-cadherin在食管癌组织中的表达与浸润深度、分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关。这与韩少华等[18]的研究发现食管癌组织中E-cadherin的表达与临床病理特征相关的结果一致。即E-cadherin在食管癌组织中的表达可作为食管癌患者临床生物学特性及预后的一个重要标志物。

有研究报道[8]，乳腺癌细胞中miR-503-3p的上调通过直接结合其mRNA 3'非翻译区来抑制上皮标志蛋白E-cadherin的表达。本研究结果显示，食管癌组织中miR-503表达与E-cadherin表达积分呈负相关，提示miR-503可能通过抑制E-cadherin的表达参与食管癌的发生、发展。经Kaplan-Meier法分析结果显示，miR-503为高表达时，患者预后5年累计生存率较差。其中，外国研究学者Ide等[19]的研究成果也发现miR-503在食管癌患者中为高表达水平，其预后效果较差。E-cadherin在食管癌患者组织中为显著低表达，与患者预后密切相关。推测食管癌组织中E-cadherin低表达可导致细胞极性和组织结构的异常改变，使细胞丧失黏附作用，促进肿瘤细胞的解离，有利于肿瘤的浸润和转移，这与Li等[20]的研究结果相一致。由此得出，参与肿瘤发生和发展的miR-503与食管癌早期发现和预后不良相关；E-cadherin也可作为评价食管鳞癌生物学特性及临床预后的一个重要标志物。

综上所述，在食管癌组织中miR-503呈高表达，E-cadherin呈低表达，二者与食管癌的发生、发展及患者预后密切相关。二者可能相互作用，共同调控食管癌的发病机制，然而，其具体机制仍不清楚，有待进一步深入研究。

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