猪星状病毒实验室检测技术研究进展

庄金秋，梅建国，张 颖，莫 玲，李 峰

(山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600)

猪星状病毒(Porcine astrovirus, PAstV)为星状病毒科哺乳动物星状病毒属成员。星状病毒(Astrovirus, AstV)是一种无囊膜包被的单股正链RNA病毒，是一类广泛存在于人和多种哺乳动物及禽类的人兽共患病病原[1-4]，广泛分布于世界各地。PAstV对哺乳期仔猪侵害较大，常引起腹泻、脱水和呕吐等临床症状，导致乳猪生长迟缓，严重者可引起死亡，给养猪业带来一定的经济损失。PAstV首次由Bridger(1980)[5]通过电镜在3周龄的乳猪腹泻粪样中观察到。Shimizu等(1990)[6]报道PAstV在猪群中普遍存在，而且常同冠状病毒、嵌杯状病毒、轮状病毒及其它肠道病毒混合感染造成猪急性胃肠炎。随后许多国家对PAstV流行病学的调查表明，PAstV在猪群具有高感染率和高血清阳性率[7]。PAstV目前发现5个差异显著的基因型(PAstVl～PAstV5)，不同地区存在不同的流行毒株[8]。PAstV在我国猪群内的流行率较高，且5个基因型均有发现。目前，本病尚无治疗药物和预防疫苗。本文就PAstV的最新实验室检测技术研究进展作一简要概述，以期为疾病的有效防控提供参考。

1 病毒分离与鉴定

1.1 病毒的分离培养

由于星状病毒在细胞培养物中的培养比较困难，而且多数星状病毒在细胞培养物中不产生细胞病变效应(CPE)，给病毒分离工作带来了难度。因此，国内外有关PAstV体外分离成功的报道较少。Lee等(1981)[9]研究发现在添加胰酶的条件下，人星状病毒可在人胚胎肾细胞(HEK)、恒河猴肾细胞(LLC-MK2)及原代狒狒肾细胞中增殖，然而即使是在胰酶存在的条件下，星状病毒也不能适应非洲绿猴肾细胞(Vero)、人胚胎肺细胞(MRC5)和仓鼠肾细胞(BHK21)等细胞系。Shimizu等(1990)[6]用猪胚肾建立的细胞系首次从患急性胃肠炎的猪中分离到一株能引起CPE的PAstV，该病毒引起的CPE特征表现在能使细胞增大和在胞浆中有细小颗粒出现。但是由于原代培养这一方法不能稳定增殖的局限性，体外分离的细胞毒株数量仍旧有限。Willcocks等(1990)[10]采用传代细胞系人类结肠癌细胞直接从粪便标本中分离星状病毒并获得成功，而无需先在HEK细胞中进行传代。近年来，国内外也有关于利用PK15细胞系成功分离PAstV的报道。商晓桂(2010)[11]通过对上海郊区某猪场疑似PAstV感染猪的粪样进行病毒分离和纯化，获得一株能在PK15细胞上增长繁殖，并使该细胞产生破碎、脱落等细胞病变的病毒，电镜观察该病毒呈典型的星状结构，直径为28～30 nm。兰家暖等(2012)[12]用PK15细胞从PAstV广西流行株中分离到2株具有CPE和致病性的PAstV，为进一步研究PAstV的分子生物学、致病机制及构建发病动物模型等奠定了基础。刘欢(2014)[8]首次使用甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮(TPCK)处理过的胰酶，成功实现了PAstV在猪肾细胞系(PK15)中的稳定增殖，CPE主要为细胞增大变圆，逐渐破碎并脱离瓶壁，有的完全破碎溶解。对细胞培养物中分离到的病毒，可用电镜及免疫荧光试验等方法进行鉴定。病毒分离的整个过程耗时费力，不适于病毒感染的快速诊断，因此很少用于临床实践。但病毒分离的成功使星状病毒可在培养细胞内大量增殖，并可用来制备针对不同血清型的单克隆和多克隆抗体，从而使检测星状病毒的免疫学方法如免疫荧光法、酶联免疫法等随之发展起来。

1.2 电镜检查

直接电镜检查在星状病毒感染的早期研究中发挥了重要的作用。Appleton等(1975)[13]首次用电镜发现了星状病毒。此方法简单，直观，此后十多年时间里，电镜是检测该病毒的主要方法。将粪便样本用蒸馏水稀释成20%悬液，离心后取上清液，用1%磷钨酸钾液(pH 7.0)染色后，电镜检查。如果粪便中有星状病毒存在，根据其特有的星状结构、28～30 nm直径等特征较易检出，必要时可将粪便浓缩处理后再做电镜检查。但是，仅有10%星状病毒具有典型的星形外观，故敏感性较低。若在标本中加入荧光标记的抗体，可提高检出率，称为免疫电镜法。但当病毒滴度低时，仍有较高的假阴性结果出现，且该方法价格昂贵，技术条件要求高，不适合大规模的流行病学调查。

2 血清学检测技术

星状病毒在培养细胞内的大量增殖，可用于制备不同血清型的单克隆和多克隆抗体，从而促进了星状病毒免疫学检测方法(如ELISA、免疫荧光等)的发展。ELISA的优点是抗原抗体均可检测，便利、快速、特异性强，并可用于分型研究，缺点是敏感性略低于电镜，且无法分辨是野毒感染还是疫苗免疫结果。免疫荧光试验和间接免疫荧光试验(IFA)主要用于对细胞培养物或组织切片中星状病毒的检测，还可检测病毒在细胞中的增殖特性和规律，对肠道内星状病毒检查，可取活体或尸体的小肠制作冰冻切片，再用免疫荧光试验检查肠上皮细胞中的星状病毒。此法简便、快速、检出率较高，但被检病料来源有一定的局限性，用于死亡动物的检测。在免疫荧光试验中，即使在48 h或72 h时出现特异性绿色荧光的细胞也只有30%～40%，说明星状病毒在体外培养条件下很难感染宿主细胞，即使感染，但对细胞的侵蚀作用不强。目前国内外尚没有商品化的PAstV血清学检测试剂盒或者疫苗。宋雅婷(2019)[14]在成功获得PAstV2-Spike、PAstV3-Spike、PAstV5-Spike重组衣壳蛋白后，以之为包被抗原蛋白建立了检测PAstV2、PAstV3、PAstV5抗体的间接ELISA方法。陈少杰(2020)[15]对PAstV4部分ORF1b基因进行扩增、原核表达及纯化，并基于重组蛋白构建了检测PAstV4抗体的间接ELISA方法，对河北地区的临床血清样品中抗体情况进行了检测，结果显示阳性率为14%(42/300)。

3 分子生物学检测技术

3.1 RT-PCR技术

RT-PCR已成为临床上检测PAstV最主要的手段。商晓桂(2010)[11]应用PK15细胞从上海某疑似PAstV感染猪场分离到的PAstV，经动物回归试验发现被攻毒猪出现了星状病毒感染的临床症状；取感染猪肠内容物，经RT-PCR检测到PAstV目的条带，表明该猪场患病猪为星状病毒感染。兰家暖等(2012)[16]采用套式RT-PCR(RT-nPCR)技术，对2008—2010年从广西7个市县29个不同规模化猪场采集的315份不同阶段猪腹泻粪样进行PAstV分子流行病学调查及基因型分析，表明PAstV在广西地区猪群中已存在。黄瑫(2015)[17]根据PAstV的RDRP基因(RNA依赖性RNA多聚酶基因)设计引物，建立RT-PCR检测方法，并将此方法用于江西地区PAstV的检测，结果显示江西地区商业猪场的PAstV在粪便中的检出率为29.2%，在肠组织中的检出率为51.7%。PAstV在健康猪和腹泻猪中都有感染，在猪群中常年存在，在冬季的感染率较高。罗璋等(2016)[18]根据PAstV2序列设计引物建立RT-PCR方法，首次在湖南地区检测到PAstV2。杨文宇等(2014)[19]根据猪A群轮状病毒(GARV)、猪C群轮状病毒(GCRV)的VP6基因和PAstV的ORF2基因分别设计引物，建立了同时检测GARV、GCRV和PAstV的三重RT-PCR方法。应用该方法检测30份四川省仔猪腹泻粪样。结果显示，GARV、GCRV、PAstV的阳性检出率分别为26.7%、13.3%、16.7%，与这3种病毒的单项RT-PCR检测结果的符合率分别为100%、100%、83%，整体符合率达94.3%，特异性为100%。顾凡等(2015)[20]根据猪嵴病毒(PKV)3D基因、PAstV的ORF2基因和猪环曲病毒(PToV)M基因序列设计3对引物，建立了同时检测PKV、PAstV和PToV的三重RT-PCR方法，对这3种疾病的鉴别诊断和混合感染检测具有重要的应用价值。曲雅新等(2020)[21]根据猪轮状病毒(PRoV)VP6基因、猪札幌病毒(PoSaV)RdRp基因和PAstV的ORF1基因序列分别设计引物，建立了同时检测PRoV、PoSaV和PAstV的三重RT-PCR方法，用于3种病原感染的临床鉴别诊断。

3.2 荧光定量RT-PCR技术

荧光定量RT-PCR与传统RT-PCR相比，特异性更强，灵敏度更高。商晓桂等(2010)[22]建立了检测PAstV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法，其方法灵敏度可达10个拷贝，是普通RT-PCR的100倍，特异性和重复性较好，为早期PAstV感染的调查及诊断提供了重要的技术支持。刘心等(2020)[23]根据PAstV3基因序列，在ORF 1b保守区设计特异性引物和TaqMan探针建立了荧光定量RT-PCR方法。使用该方法对临床收集的30份疑似PAstV3粪便样本进行检测，阳性率为40%，检出率高于RT-PCR方法。该方法的建立为PAstV3的诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。陈少杰等[24](2020)根据PAstV4基因序列，在ORF1a保守区设计特异性引物建立了SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法，为PAstV4的临床检测建立了一种快速、灵敏、特异性强的方法。

4 小结

PAstV在猪群中普遍存在，而且常与其它肠道病毒混合感染导致仔猪腹泻。据对断奶仔猪死因调查显示，腹泻引起的死亡占仔猪死亡总数的15%，每年都会对养猪业造成较大的经济损失[25]。随着分子生物学技术的发展和对PAstV的各项研究的逐步深入，人们逐步认识到PAstV的感染率和发病率均高出预期。虽然PAstV致病机制还有待于进一步的体内和体外研究，但星状病毒的多宿主性、基因差异性及其重组现象和跨种间传播及适应新宿主的能力，使得星状病毒成为潜在的新兴人畜共患病原并具有重要的公共卫生意义[25]。PAstV的血清学和分子生物学检测方法各有优点和缺点，需要根据不同的场合、条件等选择合适的方法。虽然上述检测方法为PAstV的检测提供了有效的技术手段，但是随着人们对PAstV的深入研究，相信现有的检测方法将不断的得到改进或者新的检测方法将很快研制出来，以使其检测技术更简便化、快速化和准确化，这将对PAstV病的有效防控产品及技术的研制奠定基础。