人参皂苷Rg3对环磷酰胺致免疫功能低下小鼠的免疫调节作用

郑厚胜， 郑斯文， 王英平*， 白玉洁

(1.吉林农业大学中药材学院，吉林 长春 130118；2.中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112)

环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)适用于抗肿瘤和部分免疫性疾病[1-2]。CTX是一种细胞毒性药物，它在体外没有活性，在体内它可以破坏DNA的结构，切断拷贝导致体内细胞死亡[3]。研究表明，长期使用CTX具有极大的副作用，如免疫抑制，骨髓抑制和白细胞减少[4-6]。因此，CTX经常用于构建免疫抑制的鼠模型。

药理学研究证明，人参皂苷Rg3具有调节免疫[7-9]、抗氧化[10]和神经保护作用等[11]。20(R)-Rg3可能通过减少脂质过氧化物、清除自由基和改善能量代谢来降低大鼠脑缺血性脑损伤[12]，还可以通过激活PI3K/Akt通路抑制氧化反应和炎症反应，减轻叔丁基过氧化氢引起的肝细胞坏死和凋亡[13]。Rg3可有效增强免疫功能低下小鼠的细胞免疫功能[14]，20(S)-Rg3可以直接驱动B细胞产生IgA[15]。20(R)-Rg3和20(S)-Rg3均能增强小鼠对OVA诱导的免疫反应，使细胞因子IL-12、IL-4、IL-10、IFN-γ、IgG2a和IgG3增加[16]。此外，Rg3还可以降低化学抗性诱导的PD-L1表达并恢复T细胞对癌细胞的细胞毒性。因此，Rg3被认为是靶向PD-L1的新药[8]。

1 材料

1.1 动物 雄性SPF级BALB/c小鼠，体质量(24±2)g，购自长春亿斯实验动物技术有限责任公司，实验动物生产许可证号SCXK(吉)-2017-0005。小鼠自由饮食饮水，在温度24.0 ℃、相对湿度60%下适应性饲养2周后进行实验。

1.2 细胞株 YAC-1细胞，购自中国科学院细胞库。

1.3 药物与试剂 人参皂苷Rg3(吉林大学，纯度为97%)。环磷酰胺(江苏盛迪医药有限公司)；刀豆蛋白(Concanavalin，ConA)、脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)、红细胞裂解液、Hank’s液、曲拉通TritonX-100、Enhanced Cell Counting Kit-8(CCK-8)(北京索莱宝生物科技有限公司)；无支原体胎牛血清(美国Gibco公司)；RPMI-1640培养基(美国Hyclone公司)；IFN-γ、TNF-α、IL-2试剂盒(上海朗顿生物技术有限公司)。

1.4 仪器 Allegra X-30R centrifuge离心机(美国贝克曼库尔特公司)；BB150二氧化碳培养箱(美国Thermo Scientific公司)；MDF-782超低温冰箱(日本Panasonic公司)；Allegra X-22 R冷冻离心机(美国Beckman Coulter公司)；酶联免疫检测仪(美国Bio Tek公司)。

2 方法

2.1 分组、造模及给药 60只小鼠随机分成6组，每组10只，即空白对照组(腹腔注射生理盐水)、模型组(腹腔注射生理盐水)、阳性对照组(灌胃给予盐酸左旋咪唑100 mg/kg)、低剂量组(腹腔注射人参皂苷Rg3 1 mg/kg)、中剂量组(腹腔注射人参皂苷Rg3 2.5 mg/kg)、高剂量组(腹腔注射人参皂苷Rg3 5 mg/kg)，除空白对照组外，其余各组于给药第5天时腹腔注射环磷酰胺(80 mg/kg)，连续3 d，间隔3 d后，再以相同剂量连续腹腔注射2 d,造模期间正常给药，共15 d。

2.2 小鼠脾脏指数测定 末次给药24 h后，小鼠称定体质量，摘眼球采血，颈椎脱臼处死，取脾脏，剥除结缔组织，预冷PBS冲洗残血后滤纸吸去残液，称定脾脏质量，计算脾脏指数，公式为脾脏指数=脾脏质量/体质量。

2.3 小鼠脾淋巴细胞增殖反应实验 末次给药24 h后，小鼠颈椎脱臼处死，酒精消毒3 min，超净工作台取脾，剥除结缔组织，加入3 mL Hank’s液，10 mL注射器芯研磨，过70 μm细胞筛，离心加入红细胞裂解液3 min，10%胎牛血清的RPMI1640培养液清洗2次，制得均匀细胞悬液，台盼蓝染色后计数(活细胞在95%以上)，调细胞密度为1×106/mL，设对照孔，脾细胞悬液100 μL；刺激孔，脾细胞悬液100 μL+conA(终质量浓度为5 μg/mL)、脾细胞悬液100 μL+LPS(终质量浓度为10 μg/mL)；空白孔，RPMI-1640完全培养液100 μL，在37 ℃、5%CO2培养箱中分别孵育24、48 h后，每孔加CCK-8显色剂10 μL继续孵育3 h，在450 nm下测定吸光度。

2.4 迟发型变态反应(DTH)实验 于检测前4 d，小鼠以2%无菌脱脂SRBC腹腔注射致敏，每只0.2 mL，4 d后测量左侧足趾厚度，平行3次，取平均值，并在测量处注射20%SRBC 20 μL，24 h后再次测量，平行3次，取平均值，以注射前后足趾厚度差值来表示DTH程度。

2.6 细胞因子测定 末次给药24 h后，小鼠摘眼球取血，分离血清，按ELISA试剂盒说明书中操作方法检测IFN-γ、TNF-α、IL-2水平，用Chem3D软件绘制人参皂苷Rg3化学结构, 作为对接配体，再从PDB数据库中下载IFN-γ、TNF-α、IL-2三维结构。应用Autodock分子对接软件，使用Pymol模块进行蛋白准备，删掉水分子，移除磷酸根，加上极性氢原子, 赋予电荷, 添加磁场。提取已知配体，保存文件。运用AutodockTool-1.5.6转换格式，寻找活性口袋，最后通过vina进行对接。

2.7 组织学观察 将小鼠脾脏固定在10%缓冲甲醛中，脱水透明后包埋，从石蜡块切下4 μm切片，HE染色切片，在显微镜下观察。

3 结果

3.1 人参皂苷Rg3对小鼠体质量、脾脏指数的影响 由表1、图1可知，与空白对照组比较，模型组小鼠体质量、脾脏指数降低(P<0.01)；与模型组比较，阳性对照组小鼠体质量升高(P<0.05)，而各给药组小鼠体质量无明显变化(P>0.05)，阳性对照组、各给药组小鼠脾脏指数升高(P<0.01)。

图1 人参皂苷Rg3对小鼠脾脏指数的影响

表1 人参皂苷Rg3对小鼠体质量、脾脏指数的影响

3.2 对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 由图2可知，在24、48 h后与空白对照组比较，模型组在自然、ConA刺激条件下OD值均升高(P<0.05)；与模型组比较，除阳性对照组外，各给药组在自然、ConA刺激条件下OD值提高(P<0.05，P<0.01)。与空白对照组比较，模型组在LPS刺激条件下OD值升高(P<0.01)；与模型组比较，各组在自然、LPS刺激条件下OD值均升高(P<0.01)。

注：与空白对照组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01。

3.3 人参皂苷Rg3对小鼠吞噬指数、足趾厚度差值的影响 由表2可知，与空白对照组比较，模型组小鼠吞噬指数、足趾厚度差值降低(P<0.01)；与模型组比较，各给药组小鼠吞噬指数(除低剂量组外)、足趾厚度差值升高(P<0.05，P<0.01)。

表2 人参皂苷Rg3对小鼠碳廓清及DTH的影响

3.4 人参皂苷Rg3对小鼠血清IFN-γ、TNF-α、IL-2水平的影响 由表3可知，与空白对照组比较，模型组小鼠IFN-γ、TNF-α、IL-2水平均降低(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，阳性对照组、各给药组IFN-γ、TNF-α、IL-2水平均升高(P<0.05，P<0.01)。另外，人参皂苷Rg3与靶点蛋白对接得分分别为IFN(-7.6)、IL-2(-7.3)、TNF(-9.3)，其数值越小，构想越合理，小于-7的值说明结合模式是良好的，见图3。

表3 人参皂苷Rg3对小鼠血清IFN-γ、TNF-α、IL-2表达的影响

图3 人参皂苷Rg3与IL-2、IFN-γ、TNF-α的结合

3.5 人参皂苷Rg3对免疫低下小鼠脾脏组织病理变化的影响 模型组小鼠脾脏红髓和白髓混合，小梁被拆散或消失，脾窦扩张，脾脏淋巴细胞减少；各给药组小鼠红髓和白髓混合现象明显减轻，小梁清晰可见，脾脏淋巴细胞明显增多，见图4。

注：A为空白对照组，B为模型组，C为阳性对照组，D为低剂量组，E为中剂量组，F为高剂量组。

4 讨论

研究表明，Rg3具有多种药理活性，包括调节免疫系统。通过刺激树突状细胞(DC)，促进Th1细胞分泌细胞因子，还可以诱导CD4+T细胞(Th)向Th1型分化[9]。其与化疗药物联用，可以发挥抗肿瘤作用[17-18]。人参皂苷Rg3有两种类型，20(R)-Rg3和20(S)-Rg3，可以立体特异性的促进免疫反应，20(R)-Rg3在临床上用于癌症治疗或其它免疫介导的疾病时效果更佳[16]。

脾脏是成熟T细胞、B细胞定居的场所，具有合成生物活性因子、过滤和净化血液的作用。抗原或有丝分裂原可引起T和B淋巴细胞的分裂，ConA诱导的细胞分裂常用于检测T淋巴细胞免疫活性，LPS诱导的细胞分裂常用于检测B淋巴细胞免疫活性[19]。IL-2是Th1细胞产生的重要免疫因子, 与 IL-2受体结合后可诱发免疫细胞的增殖，抑制肿瘤细胞分裂[20]，并增强NK细胞的活性[21]，从而增加IFN-γ的产生[22]。IL-2还促进B细胞的分化和分泌，IL-2与IL-21共同刺激幼稚B细胞，其产生浆细胞的频率和分泌的IgM、IgG和IgA的量增加了2至5倍[23]。肝、脾等处的巨噬细胞会清除血液中的碳粒，活性越强，清除能力越强，而TNF-α是活化的单核细胞和淋巴细胞的产物。在本实验中，通过腹腔注射人参皂苷Rg3，可以提高免疫低下小鼠的脾脏指数、脾淋巴细胞增殖活性、NK细胞的活性及碳廓清能力。这表明Rg3可能通过调节免疫低下小鼠血清IL-2、TNF-α的水平, 对抗CTX对小鼠免疫细胞活性的抑制，从而达到调节免疫的作用。由分子对接可知人参皂苷Rg3与IL-2、IFN-γ、TNF-α主要通过氢键和π-π堆积等相互作用进行结合。人参皂苷Rg3与IL-2、IFN-γ主要通过3条氢键相连、与TNF-α主要通过3条氢键、2条π-π堆积相连，拥有较好的结合模式。

腹腔注射不同剂量的Rg3对CTX致免疫低下小鼠的脾脏指数、脾淋巴细胞增殖能力、NK细胞杀伤能力及碳廓清能力的提高都呈现良好的剂量依赖性。但对于小鼠体质量的增加、胸腺损伤的修复及外周血白细胞数并没有明显提高，建议增加药物配伍使用，增强对胸腺组织损伤的修复，以进一步增强化疗患者的免疫功能。