川芎化学成分及其抑制子宫平滑肌收缩作用(Ⅱ)

冯 芮， 彭 成， 周 飞， 郭 力， 刘 娟*， 熊 亮*

(1.成都中医药大学药学院省部共建西南特色中药资源国家重点实验室，四川 成都 611137；2.成都中医药大学西南特色药材创新药物成分研究所，四川 成都 611137)

川芎为伞形科藁本属多年生草本植物LigusticumstriatumDC.(同名Ligusticumchuanxiong)的干燥根茎，为著名川产道地药材。其性辛、温，归肝、胆、心包经，具有祛风止痛、活血行气的功效。川芎生物碱是川芎重要的活性部位，在心脑血管保护[1-2]、抗偏头痛[3]、抗血小板聚集[4]、神经保护[5]和抑制子宫平滑肌收缩[6]等方面发挥着重要作用，目前针对川芎生物碱成分的研究主要集中在川芎嗪，对于其他生物碱成分研究较少，截止目前，仅报道了20余种生物碱类成分[7-10]，因此，针对川芎生物碱类成分研究具有较好的创新性。本课题组前期首次发现其能显著抑制子宫平滑肌收缩[6]。但川芎生物碱抑制子宫平滑肌的物质基础尚不清楚，课题组又进一步明确了二酮哌嗪生物碱是抑制子宫平滑肌收缩的物质基础[10]。为进一步完善和丰富川芎生物碱类成分，弥补川芎抑制子宫平滑肌物质基础研究的匮乏，本课题组对川芎生物碱部位进行持续研究，从中获得了10个生物碱化合物，并结合缩宫素致大鼠离体子宫平滑肌收缩模型考察其对子宫平滑肌收缩活动的影响，发现化合物2、5在50 μmol/L时具有抑制大鼠离体子宫平滑肌收缩作用。

1 材料

1.1 仪器 Búchi Gradient Former B-687中压液相色谱仪(瑞士Búchi公司)；Agilent 1220型半制备型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；Bruker AVANCE NEO-600 核磁共振波谱仪、Bruker AVANCE NEO-700 核磁共振波谱仪(德国Bruker公司)；D101大孔吸附树脂(成都科龙化工试剂厂)；732型阳离子交换树脂(河北华伟树脂厂)；柱层析硅胶(200～300目，青岛海洋硅胶干燥剂厂)；葡聚糖凝胶Sephadex LH-20(40～70 μm，瑞典Amersham Pharmacia公司)；薄层层析硅胶GF254(青岛海洋硅胶干燥剂厂)；高效薄层GF254、硅胶制备薄层(烟台江友硅胶开发有限公司)；FA2004B电子天平(上海越平科学仪器有限公司)；Powerlab多功能生理记录仪、恒温水浴槽和Labchart Pro专业版软件[澳大利亚埃德仪器国际贸易(上海)有限公司]；DZKW-S-4电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)。

1.2 试剂 95%乙醇、正丁醇、氨水、甲醇、二氯甲烷、二甲亚砜等分析纯试剂(成都科隆化工试剂厂)；色谱甲醇，4 L/瓶(美国Sigma公司)；显色剂碘蒸气、改良碘化铋钾试剂(上海易恩化学技术有限公司)。缩宫素注射液(江西省创欣药业集团有限公司，批号191011，规格2 mL:10单位，使用时用生理盐水配成 1 U/mL)；戊酸雌二醇片(拜耳医药保健有限公司广州分公司，批号498A，规格1 mg/片，使用时用纯水制备成0.8 mg/mL)。

1.3 药材 川芎饮片由四川新绿色药业科技发展股份有限公司提供，经成都中医药大学高继海副教授鉴定为伞形科多年生草本植物川芎LigusticumstriatumDC.的根茎，标本(LC-20161030)现保存在成都中医药大学“省部共建西南特色中药资源国家重点实验室”。

1.4 动物 健康未孕成年SD大鼠，普通级，雌雄，体质量220～250 g，由成都达硕实验动物有限公司提供[动物生产许可证号SCXK(川)2015-030]。

2 提取与分离

100 kg干燥川芎，煎煮3次(每次8倍量纯水，2.5 h)，合并水煎液浓缩后得到川芎水提取物(28.8 kg)。该水提物用正丁醇萃取，浓缩后得到正丁醇萃取物(9.3 kg)。正丁醇萃取物再用D101大孔吸附树脂进行分离，用0%、10%、30%、50%、70%、95%乙醇进行梯度洗脱，浓缩后得到6个洗脱部位。取30%乙醇水洗脱部位(701 g)用离子交换树脂进行生物碱富集，依次用纯水、75%乙醇、75%氨水乙醇梯度洗脱，回收溶剂得到3个洗脱部分。将75%氨水乙醇部分(120 g)采用硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇(100∶1～0∶1)洗脱，获得9个馏分(F1～F9)。

采用反相中压液相色谱分离馏分F6，甲醇溶液(10%～100%)梯度洗脱后得到9个洗脱部分(F6-a～F6-i)，F6-c采用反相Sephadex LH-20柱，以85%甲醇水溶液洗脱后得到7个部分(F6-c-1～F6-c-7)，F6-c-2经硅胶柱，用二氯甲烷-甲醇(80∶1～0∶100)梯度洗脱得到5个部分(F6-c-2a～F6-c-2e)，F6-c-2a经反相半制备高效液相色谱，以甲醇-水(30∶70)处理后得化合物1(3.0 mg)、2(2.7 mg)。F6-c-2b经制备薄层色谱，以二氯甲烷-甲醇(13∶1)洗脱和反相半制备高效液相色谱(46%甲醇-水溶液)处理后得化合物3(1.0 mg)、4(2.8 mg)。F6-c-3经硅胶柱，以二氯甲烷-甲醇(80∶1～0∶100)梯度洗脱得到6个部分(F6-c-3a～F6-c-3f)，F6-c-3b经制备薄层色谱，二氯甲烷-甲醇(10∶1)洗脱和反相半制备高效液相(40%甲醇-水溶液)处理后得化合物5(4.3 mg)、6(0.8 mg)、7(3.1 mg)。F6-c-4经硅胶柱，用二氯甲烷-甲醇(100∶1～0∶100)梯度洗脱得到8个部分(F6-c-4a～F6-c-4h)，F6-c-4c经制备薄层色谱，以二氯甲烷-甲醇(10∶1)洗脱和反相半制备高效液相色谱(50%甲醇-水溶液)处理后得化合物8(0.7 mg)。F6-c-5经硅胶柱，以二氯甲烷-甲醇(100∶1～0∶100)梯度洗脱得到7个部分(F6-c-5a～F6-c-5g)，F6-c-5b和F6-c-5d经反相半制备高效液相色谱，分别以甲醇-水(62∶38)和甲醇-水(60∶40)处理后得到化合物9(0.9 mg)、10(3.2 mg)。

3 结构鉴定

化合物1：白色粉末，易溶于甲醇；碘蒸熏显黄色，改良碘化铋钾显蓝色。ESI-MSm/z：257.1[M+Na]+，分子式C12H14N2O3。1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δ：7.34～7.21(5H，m，H-10，11，12，13，14)，4.24～4.20(1H，m，H-3)，3.85～3.82(1H，m，H-6)，3.44(1H，dd，J=3.6，11.4 Hz，H-7a)，3.24(1H，dd，J=6.6，13.8 Hz，H-8a)，3.12(1H，dd，J=4.8，13.8 Hz，H-8b)，2.88(1H，dd，J=6.0，10.8 Hz，H-7b)；13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δ：169.5(C-5)，168.2(C-2)，137.3(C-9)，131.3(2C，C-10，14)，129.7(2C，C-11，13)，128.2(C-12)，64.7(C-7)，58.7(C-6)，57.6(C-3)，41.6(C-8)。以上数据与文献[11]报道基本一致，故鉴定为环(L-苯丙氨酸-L-丝氨酸)。

化合物2：白色粉末，易溶于甲醇；碘蒸熏显黄色，改良碘化铋钾显蓝色。ESI-MSm/z：257.1[M+Na]+，分子式C12H14N2O3。1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δ：7.31～7.21(5H，m，H-10，11，12，13，14)，4.31(1H，t，J=4.2 Hz，H-3)，3.75(1H，dd，J=3.6，11.4 Hz，H-7a)，3.56(1H，dd，J=3.6，11.4 Hz，H-7b)，3.26(1H，dd，J=4.2，13.8 Hz，H-8a)，3.05～2.98(2H，m，H-6，8b)；13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δ：170.2(C-5)，169.1(C-2)，136.5(C-9)，131.5(2C，C-10，14)，129.5(2C，C-11，13)，128.3(C-12)，63.5(C-7)，57.6(C-6)，57.3(C-3)，40.4(C-8)。以上数据与文献[11]报道基本一致，故鉴定为环(D-苯丙氨酸-L-丝氨酸)。

化合物3：白色粉末，易溶于甲醇；碘蒸熏显黄色，改良碘化铋钾显蓝色。ESI-MSm/z：298.1[M+Na]+，分子式C14H17N3O3。1H-NMR(CD3OD，600 MHz)，δ:7.29(2H，t，J=7.2 Hz，H-14，16)，7.24(1H，t，J=7.2 Hz，H-15)，7.21(2H，d，J=7.2 Hz，H-13，17)，4.33(1H，t，J=4.8 Hz，H-3)，3.81(1H，t，J=6.0 Hz，H-6)，3.31(1H，m，H-11a)，2.95(1H，dd，J=4.8，13.8 Hz，H-11b)，1.84(2H，t，J=8.4，CH2-8)，1.30(1H，m，H-7a)，1.00(1H，m，H-7b)；13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δ：174.2(C-9)，169.3(C-5)，169.0(C-2)，136.7(C-12)，131.7(2C，C-13，17)，129.6(2C，C-14，16)，128.5(C-15)，57.4(C-3)，54.8(C-6)，40.0(C-11)，30.4(C-8)，30.0(C-7)。以上数据与文献[12]报道基本一致，故鉴定为环(L-苯丙氨酸-L-谷氨酰胺)。

化合物4：白色粉末，易溶于甲醇；碘蒸熏显黄色，改良碘化铋钾显蓝色。ESI-MSm/z：241.1[M+Na]+，分子式C13H18N2O。1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δ：7.30～7.24(2H，m，H-11，15)，7.24～7.19(3H，m，H-12，13，14)，4.31(1H，t，J=5.4 Hz，H-2)，3.64(1H，d，J=4.2 Hz，H-5)，3.23(1H，dd，J=5.4，13.8 Hz，H-6a)，3.04(1H，dd，J=4.8，13.8 Hz，H-6b)，1.64(1H，m，H-7)，0.79(3H，d，J=6.6 Hz，CH3-8)，0.43(3H，d，J=6.6 Hz，CH3-9)；13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δ：169.4(C-4)，137.1(C-10)，131.5(2C，C-11，15)，129.6(2C，C-12，14)，129.2(C-13)，61.3(C-5)，57.3(C-2)，40.1(C-6)，33.3(C-7)，19.1(C-8)，17.1(C-9)。以上数据与文献[13]报道基本一致，故鉴定为2-isopropyl-5-phenylmethyl-imidazolidinone-4-one。

化合物5：白色粉末，易溶于甲醇，碘蒸熏显黄色，改良碘化铋钾显蓝色。ESI-MSm/z：241.1[M+Na]+，分子式C12H14N2O2。1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δ：7.33～7.19(5H，m，H-10，11，12，13，14)，4.31(1H，t，J=4.2 Hz，H-3)，3.76(1H，q，J=7.2，13.8 Hz，H-6)，3.28(1H，dd，J=4.2，13.8 Hz，H-8a)，2.96(1H，q，J=4.2，13.8 Hz，H-8b)，0.52(1H，d，J=7.2 Hz，CH3-7)；13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δ：170.6(C-2)，168.5(C-5)，136.6(C-9)，131.8(2C，C-10，14)，129.5(2C，C-11，13)，128.3(C-12)，57.4(C-6)，51.7(C-3)，40.3(C-8)，20.4(C-7)。以上数据与文献[14]报道基本一致，故鉴定为环(L-苯丙氨酸-L-丙氨酸)。

化合物6：白色粉末，易溶于甲醇；碘蒸熏显黄色，改良碘化铋钾显蓝色。ESI-MSm/z：299.1[M+Na]+，分子式C15H20N2O3。1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δ：7.02(2H，d，J=8.4 Hz，H-13，17)，6.70(2H，d，J=7.8 Hz，H-14，16)，4.26(1H，m，H-3)，3.70(1H，m，H-6)，3.18(1H，dd，J=4.2，13.8 Hz，H-11a)，2.89(1H，dd，J=6.4，13.8 Hz，H-11b)，1.41(1H，m，H-7)，1.18(1H，m，CH2-9)，0.76(3H，d，J=6.6 Hz，CH3-8)，0.71(3H，t，J=7.2 Hz，CH3-10)；13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δ：170.0(C-5)，167.9(C-2)，157.0(C-15)，132.6(2C，C-13，17)，127.2(C-12)，116.3(2C，C-14，16)，60.9(C-6)，57.5(C-3)，39.8(C-7)，38.9(C-11)，24.7(C-9)，15.4(C-8)，11.9(C-10)。以上数据与文献[15]报道基本一致，故鉴定为环(L-酪氨酸-L-亮氨酸)。

化合物7：白色粉末，易溶于甲醇；碘蒸熏显黄色，改良碘化铋钾显蓝色。ESI-MSm/z：333.1[M+Na]+，分子式C18H18N2O3。1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δ：7.34(2H，t，J=7.2 Hz，H-17，19)，7.25(1H，t，J=7.2 Hz，H-18)，7.11(2H，d，J=7.2 Hz，H-16，20)，6.94(2H，d，J=7.8 Hz，H-9，13)，6.76(2H，t，J=7.8 Hz，H-10，12)，4.07(1H，m，H-3)，4.05(1H，m，H-6)，2.81(1H，dd，J=4.2，13.8 Hz，H-14a)，2.72(1H，dd，J=3.6，13.8 Hz，H-7a)，2.19(1H，dd，J=6.6，13.8 Hz，H-7b)，2.10(1H，dd，J=7.2，13.8 Hz，H-14b)；13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δ：169.2(C-5)，169.1(C-2)，157.9(C-11)，137.3(C-15)，132.3(2C，C-9，13)，131.1(2C，C-16，20)，129.8(2C，C-17，19)，128.2(C-18)，127.6(C-8)，116.5(2C，C-10，12)，57.7(C-6)，57.5(C-3)，41.2(C-14)，40.2(C-7)。以上数据与文献[16]报道基本一致，故鉴定为环(L-苯丙氨酸-L-酪氨酸)。

化合物8：白色粉末，易溶于甲醇；碘蒸熏显黄色，改良碘化铋钾显橘红色。ESI-MSm/z：147.1[M+H]+，分子式C8H6N2O。1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δ：8.24(1H，dd，J=1.8，7.8 Hz，H-5)，8.10(1H，s，H-2)，7.85(1H，td，J=1.2，7.8 Hz，H-6)，7.71(1H，d，J=7.8 Hz，H-8)，7.57(1H，td，J=1.2，7.8 Hz，H-7)。以上数据与文献[17]报道基本一致，故鉴定为4(3H)-喹唑酮。

化合物9：白色粉末，易溶于甲醇；碘蒸熏显黄色，改良碘化铋钾显橘红色。ESI-MSm/z：146.1[M+H]+，分子式C9H7NO。1H-NMR(CD3OD，700 MHz)δ：8.52(1H，d，J=2.8 Hz，H-2)，7.91(1H，d，J=7.7 Hz，H-8)，7.75(1H，m，H-5)，7.55～7.49(3H，m，H-4，6，7)；13C-NMR(CD3OD，175 MHz)δ：152.7(C-3)，144.5(C-8a)，143.6(C-2)，131.0(C-4a)，128.8(C-8)，128.3(C-6)，127.7(C-7)，127.6(C-5)，117.9(C-4)。以上数据与文献[18]报道基本一致，故鉴定为3-羟基喹啉。

化合物10：白色粉末，易溶于甲醇；碘蒸熏显黄色，改良碘化铋钾显橘红色。ESI-MSm/z：169.1[M+H]+，分子式C11H8N2。1H-NMR(CD3OD，700 MHz)δ：8.96(1H，s，H-4)，8.28(1H，m，H-7)，8.04(1H，m，H-8)，7.62(1H，d，J=3.5 Hz，H-2)，7.61～7.56(2H，m，H-6，9)，7.13(1H，d，J=3.5 Hz，H-1)；13C-NMR(CD3OD，175 MHz)δ：142.8(C-5a)，138.6(C-4)，130.6(C-9b)，130.1(C-3a)，129.4(C-2)，129.1(C-8)，127.2(C-6)，127.0(C-9)，125.1(C-9a)，124.4(C-7)，101.8(C-1)。以上数据与文献[19]报道基本一致，故鉴定为marinoquinoline K。

4 对大鼠离体子宫平滑肌收缩活动的影响

川芎生物碱成分对缩宫素致子宫平滑肌收缩活动影响的实验结果，见表1，与空白组比较，化合物2、5对子宫平滑肌收缩活动影响较小，仅在50 μmol/L时表现出对子宫平滑肌收缩张力有影响(P<0.05)，12.5、25 μmol/L浓度下对子宫平滑肌收缩作用均不明显(P>0.05)。本研究结果与前期基础实验结果一致，进一步明确了二酮哌嗪生物碱是抑制子宫平滑肌收缩的物质基础。

表1 各化合物对子宫平滑肌收缩活动的影响

5 讨论

本实验遵循川芎传统使用方法，持续对其水煎液进行研究，从水煎液正丁醇部位中获得10个生物碱类化合物，这些生物碱均为首次从川芎中分离得到，包含6个二酮哌嗪类生物碱(1～3、5～7)、1个咪唑啉酮类(4)、1个喹唑酮类(8)以及2个喹啉类生物碱(9～10)。其中，与大部分生物碱的碘化铋钾显橘红色不同的是，二酮哌嗪多显蓝色，可为后续二酮哌嗪的快速分离提供参考。川芎生物碱作为川芎的重要活性部位，具有脑保护、神经保护、抗偏头痛、抗心肌缺血、舒张子宫平滑肌等多种药理活性。而目前主要针对吡嗪类生物碱川芎嗪进行广泛而深入的研究，包括提取工艺、含量测定、人工合成、活性机制等，其他生物碱研究报道很少，相较于之前报道的20余个生物碱化合物[7-10]，本实验进一步丰富了川芎化学成分，以期弥补川芎生物碱类成分报道的缺乏。

二酮哌嗪是广泛存在于自然界的最小环肽类化合物，现代药理研究表明二酮哌嗪类生物碱具有抗细菌、抗真菌、抗病毒等多种药理活性。本课题组前期发现川芎生物碱对子宫平滑肌收缩具有显著的抑制作用，并发现其中的活性成分(二酮哌嗪生物碱)，本实验在前期实验基础之上，考察了川芎生物碱成分抑制子宫平滑肌收缩活性，并发现化合物2、5也具有一定的舒张子宫平滑肌作用，进一步明确了二酮哌嗪生物碱是抑制子宫平滑肌收缩的物质基础，以期为阐释川芎传统功效提供参考。