长链非编码RNA CTC-459F4.3对肝癌细胞干性增殖及凋亡的影响

王波金雯周健坤曹立宇

（1.铜陵职业技术学院医学护理系，安徽 铜陵 244061；2.安徽医科大学第一附属医院病理科，安徽 合肥 230021）

肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）属全球高发性恶性肿瘤，病死率位居恶性肿瘤第二位［1］，其早期复发、转移是影响患者预后生存的关键.研究指出，HCC患者中能够在早期接受有效治疗的仅占30%～40%，而针对HCC 早期诊断的临床肿瘤标记物欠缺敏感性和多样性［2］.HCC 早期诊断及治疗的研究一直以来是科学家们的焦点，因此寻找具有灵敏且特异性强的肝癌目标基因，实现早期诊疗、提高预后显得尤为迫切和重要.近年来，长链非偏码RNA（Long non-coding RNA，Lnc RNA）已成为恶性肿瘤生物学行为研究领域的热点基因.诸多研究显示［3-5］，Lnc RNA可参与调节恶性肿瘤细胞周期、介导信号调控、影响肿瘤耐药和微血管生成等，而不同的Lnc RNA在各种脏器或组织中呈特异性表达.本研究旨在观察并探讨Lnc RNA家族新成员CTC-459F4.3表达下调对HCC干性增殖及凋亡的影响，以期为HCC的有效诊治提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料来源

HepG2细胞培养于ATCC细胞库.

1.2 主要试剂与仪器

CTC-459F4.3 shRNA 慢病毒质粒（上海吉凯）；DMEM、RPMI 1640、PBS，pH7.4（Gibco，公司）；胎牛血清（Bio IND，04-002-1A）；Antibiotic-Antimycotic、Trypsin-EDTA（0.05%）、牛血清白蛋白（Lifetechnologies）；PI-Annexin V 试剂盒（日本同仁化学，AD10）；酶标仪（BioTek，EPOCH）；流式细胞仪（ACEN，NovoCyte）等.

1.3 方法

1.3.1 细胞培养与转染

HepG2细胞系置于10%胎牛血清，5%CO2、37℃的培养箱中，相对湿度90%.0.125%胰蛋白酶作用后，培养基轻洗1次.加入DMEM/RPMI 1640培养基5mL，反复吹打，制成细胞悬液，1：2分瓶置于25mL培养瓶中.于对数期接种于6孔板中，每孔滴入一定滴度的慢病毒转染48h，收集并观察细胞转染效率.

1.3.2 RT-PCR检测CTC-459F4.3mRNA表达

分别设CTC-459F4.3 敲低组、对照组、空质粒组.600μl BufferRL 滴入细胞悬液，反复吹打，裂解、离心后，收集mRNA溶液.分光光度计定量提取10ug估算总量，超低温保存.按照cDNA反转录说明书配置反应体系，行扩增实验.50℃，2min；95℃，10min；40循环，实验重复3次.采用2-ΔΔCt法计算CTC-459F4.3 mRNA 相对表达量.引物序列由华大基因合成，Primer3 软件设计如下：CTC459F4.3-F：TGCCCCTGGTCCCCTTGTCG；CTC459F4.3-R：TCTGCTGGCCTTGTCTGGCG.

1.3.3 肝癌瘤球成形实验

将生长状态良好的细胞消化后离心，去除含血清培养基，PBS清洗两次；用DMEM/F12培养基重悬细胞，并计数.选择超低吸附细胞培养板，每孔500-5000个细胞，补加培养基，10d左右完成培养，实验重复3次.观察细胞成球计数并拍照.

1.3.4 流式技术检测细胞凋亡率

各组细胞分别1000rpm离心5min；用1×Annexin V Binding Solution 调整细胞密度到1×106/mL的悬液；取100ul 细胞悬液，加入5ul 的AnnexinV-FITC 结合物，再加入5ul PI solution；室温避光15min；加入400ul 1×Annexin V Binding Solution，1h内上机行细胞凋亡测定.

1.3.5 Western-Blot检测

提取目标基因总蛋白，SDS－PAGE 电泳1.5h，4%浓缩胶电流为25mA，12%分离胶电流为30mA.400mA转膜转移0.5h、1%BSA封闭40min；一抗4℃孵育过夜；二抗孵育37℃1h；PBS清洗3次.ECL显色、荧光拍照，凝胶图像系统分析灰度值.

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 CTC-459F4.3 shRNA转染效率判定

CTC-459F4.3 敲低组、对照组、空质粒组CTC-459F 4.3mRNA 表达量分别为：0.376±0.032、0.746±0.0492、0.716±0.011；组间比较发现，敲低组CTC-459F4.3mRNA表达量与对照组和空质粒组比较均有显著差异（F=105.408，P<0.001）；对照组CTC-459F4.3mRNA 表达量与空质粒组比较无差异（P=0.330）.

2.2 Western-Blot检测结果

Western-Blot 灰度分析显示，CTC-459F4.3 敲低组、对照组、空质粒组SOX2 相对表达量分别为6.041±0.070、1.234±0.081、1.221±0.096，组间比较差异有统计学意义（F=3370.154，P<0.001）；敲低组与对照组、空质粒组相比有差异（P<0.001），对照组与空质粒组相比无差异（P=0.850）.4-OCT 相对表达量分别为5.849±0.575、1.321±0.027、1.463±0.059 组间比较差异有统计学意义（F=178.251，P<0.001），敲低组与对照组、空质粒组相比有差异（P<0.001），对照组与空质粒组相比无差异（P=0.620），见图1.

图1 注：a：各组SOX2和4-OCT Western-Blot灰度图；b：各组SOX2和4-OCT相对表达量

2.3 肝癌瘤球成形实验结果

CTC-459F4.3 敲低组、对照组、空质粒组瘤球成球数依次为32.583±3.502、8.417±0.996、9.333±1.775.敲低组瘤球成球数显著高于对照组、空质粒组，差异有统计学意义（F=411.515，P<0.001）；对照组与空质粒组细胞瘤球成球数相比无明显差异（P=0.301）.见图2

图2 a：CTC-459F4.3基因敲除组；b：对照组；c：空质粒组；d：各组细胞成球数结果

2.4 流式技术检测细胞凋亡结果

CTC-459F4.3 敲低组、对照组、空质粒组细胞凋亡率依次为（4.063±0.017）%、（7.980±0.064）%、（8.013±0.030）%.敲低组细胞凋亡率显著低于对照组、空质粒组，差异有统计学意义（F=88.704，P<0.001）；对照组与空质粒组细胞凋亡率相比无明显差异（P=0.925）.见图3

图3 a：CTC-459F4.3基因敲除组；b：对照组；c：空质粒组；d：各组细胞凋亡率结果

3 讨论

肝癌干细胞（Liver Cancer Stem Cell，LCSCs）作为母源性肿瘤细胞存在于HCC 之中，具有强大的自我更新和分化功能，在肝癌进展中发挥重要作用.Lnc RNAs 的异常表达在LCSCs 生物学活动中充当重要角色，刘晨等［6］认为LCSCs是肝癌的起源，LncRNA NEAT1高表达可能通过活化Hippo信号通路进而实现了LCSCs 扩增与自我更新的促进. LncRNA KCNQ1OT1 可通过竞争性结合mi⁃croR-NA-504 促进HCC 的增殖［7］.LncRNA CTC-459F4.3 为新近发现的基因，有关其与肝癌发生、发展关系的报道并不多见，有研究显示，LncRNA RNA CTC-459F4.3过表达可通过上调CTDSPL抑制肝癌细胞的增殖和迁移，但具体机制并未阐明［8］.LncRNA RNA CTC-459F4.3更多地被应用于基因共表达网络分析中的协同作用，一项肺腺癌的基因谱网络分析研究发现其为核心因子之一，可参与调控多种其它基因［9］.

SOX2和OCT4是多能性干细胞调控因子，它们在胚胎发育、肿瘤发生发展中发挥促进细胞自我更新以及增殖等功能，是肿瘤干细胞特性的重要分子标记物.SOX2可通过调控Wnt/β-catenin通路影响胃癌的进展［10］.Oct4高表达可增强恶性肿瘤细胞的自我更新和分化能力与CRC患者的肝转移密切相关［11］.血管生成是恶性肿瘤的主要生物学特性之一，与癌细胞干性增殖关系密切［12］，也是恶性肿瘤靶向治疗的重要路径之一.Oct4在LCSCs血管生成中起到至关重要的作用，具体机制可能为通过介导AKT-NF-kB-p65信号轴实现的［13］.在SOX2与OCT4结合的复合物结构中，OCT4/Lys-151和SOX2/Asp-107可形成明显的盐桥结构，其在蛋白修饰以及残基突变中可以影响肿瘤细胞干性特征的稳定性［14］.可见，SOX2和OCT4在肿瘤进展过程中扮演了重要角色，为此，本研究采用West⁃ern-Blot技术检测2个基因的表达水平，以进一步探讨LncRNA RNA CTC-459F4.3调低后对HCC干性能力的影响.

实验结果显示，CTC-459F4.3shRNA 慢病毒质粒可成功转染并构建CTC-459F4.3 低表达的HepG2 肝癌细胞系；CTC-459F4.3 调低后，SOX2 和OCT4 相对表达量显著上调（P<0.001），提示CTC-459F4.3可能以直接或间接的方式参与了SOX2和OCT4表达水平的调控从而实现对HCC细胞的干性能力的影响.为进一步明确CTC-459F4.3调低后对HCC的生物学活动作用，肝癌瘤球成形实验结果显示，CTC-459F4.3 调低组的肝癌细胞的聚集和增殖能力显著增强；流式技术检测显示，CTC-459F4.3 调低组的肝癌细胞凋亡率下降. 基于上述推测，调低CTC-459F4.3 可通过SOX2 和OCT4增强HCC细胞的干性能力获得，并可促进肝癌细胞的干性增殖和细胞凋亡抑制，在肝癌进展中可能起到了负性调控作用，这与张军等［8］的研究结果一致.癌细胞的干性能力与肿瘤的恶性程度成正相关性，LCSCs可能是HCC耐药、高复发和转移的源头［15-16］.CSCs可能促成了肿瘤细胞向成熟肿瘤细胞分化过程中的耐药突变以及耐药维持［17］.上述提示，针对LCSCs进一步研究CTC-459F4.3的作用，可能为HCC的早期诊断、复发转移防治及抗肿瘤耐药等方面提供新的思路.

综上，CTC-459F4.3表达调低可以促进肝癌细胞干性增殖、抑制其凋亡，有望成为肝癌诊治的新靶点.而该基因与肝癌进展关系的详细机制目前尚不明确，仍需进一步研究.