振动胁迫对双孢菇褐变与抗氧化能力的影响

陈代良，陈杭君，刘瑞玲，韩延超，吴伟杰，郜海燕

（浙江省农业科学院食品科学研究所，农业农村部果品产后处理重点实验室，浙江省果蔬保鲜与加工技术研究重点实验室，中国轻工业果蔬保鲜与加工重点实验室，杭州 310021）

0 引 言

双孢菇（Agaricus bisporus）又称白蘑菇，是世界上种植最广泛的食用菌，富含维生素B3、烟酸、叶酸、矿物元素等营养成分，风味独特且具有较强的抗氧化性，为低脂、低热量、高蛋白的健康食物。然而，双孢菇子实体含水率高，采后贮藏与运输过程中呼吸作用旺盛，极易失水萎蔫；其外表面没有显著的保护组织，极易受到机械损伤，导致子实体褐变直至腐烂变质，最终降低双孢菇的食用品质和商品价值[1]。

随着中国果蔬电商物流产业的飞速发展，双孢菇在国内远距离运输销售的需求快速增长，其物流形式主要是汽车公路运输。通常认为运输过程中的振动胁迫是造成果蔬机械损伤的主要原因[2-3]，振动胁迫不仅影响果蔬外观，也会影响其贮藏品质[4-5]。目前，研究振动胁迫对果蔬的影响主要通过模拟运输技术实现。例如，肖越等[6]在4 Hz条件下对巨峰葡萄（Vitis viniferaL.）进行5 min的模拟运输振动试验发现与未振动处理组相比，无包装振动处理的葡萄内部损伤较为严重，口感下降；周然等[7]通过模拟车辆运输技术发现振动频率为2～5 Hz时会在运输过程中产生较高的振动能量。

振动时间、振动频率以及振动加速度是运输过程中影响果蔬品质的主要因素，其中振动时间影响较为直接，与运输距离呈正相关，振动时间越长，果蔬间相互摩擦碰撞的次数越多，会对果蔬表皮组织造成即时损伤，这种损伤会逐步传递至果蔬内部，造成延时损伤。卢立新等[8]模拟实际公路运输，研究了振动胁迫对梨果实（Pyrusspp.）品质的影响，发现运输振动对梨果实的损伤随时间的增加而增大。许时星等[9]通过对蓝莓（Vacciniumspp.）进行模拟运输振动发现，果实的衰老速度随振动时间的增加而延长，振动时间越久，品质劣变越快。本文研究了冷藏运输条件下振动胁迫对双孢菇贮藏品质和抗氧化能力的影响，揭示抗氧化性与贮藏品质的关系，并明确双孢菇表皮的损伤情况，旨在为开发物流减震包装技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

双孢菇采自浙江省嘉善县宁远农业开发有限公司，品种为W192。在基地采收后即运往实验室，在(2±1)℃、相对湿度90%～95%条件下放入冷库预冷12 h，挑选菇形圆整、色泽洁白、未开伞、无机械损伤、菌盖直径35～40 mm的双孢菇作为试验材料。

1.2 仪器与设备

邮政4号标准泡沫箱（外部长度、宽度、高度分别为34 cm×22 cm×18 cm，内部长度、宽度、高度分别为30 cm×18 cm×14 cm，壁厚2 cm，容量7.5 L），翼洋泡塑工厂；M/MN-100R型模拟运输振动试验台，上海睦尼实验设备有限公司；TA.XT.Plus物性测定仪，英国 Stable Micro Systems 公司；Thermo Biofuge startos型冷冻离心机，美国Thermo Fisher Scientific公司；DK-8D恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；WFZ UV-2802型紫外分光光度计，UNICO（上海）仪器有限公司；ME103E电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；CR-400手持色差仪，日本KONIC MINOLTA公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

将运输模拟振动试验台移至冷库中，冷库环境设置为（4±1）℃、相对湿度90%～95%。双孢菇分为4组，每组5 kg样品，用邮政4号标准泡沫箱盛放，由于汽车运输振动频率集中在2～5 Hz，本试验振动试验台每分钟振动200次（振动频率3.33 Hz），以不做振动处理的双孢菇为对照组，另3组同时置于振动台开始振动，分别振动8、16和24 h后取下放在冷库中贮藏，每3 d取一次样，测量双孢菇相关贮藏品质指标，贮藏15 d，共取样6次。

1.3.2 菌盖色泽测定

使用色差仪在双孢菇菌盖部位随机测定L*值、a值和b值并记录，每个处理组测定5次。褐变指数（BI值：Browning Index）的计算方法[10]按照以下公式计算：

其中

ΔE表示与理想双孢菇色泽（L*=97、a=－2、b=0）相比，双孢菇颜色的变化程度，用以下公式进行计算。

式中L*为亮度值；a为红绿色度值；b代表黄蓝色度值。

1.3.3 细胞膜渗透率测定

参考曹建康等[11]的方法并有所改动。使用打孔器从双孢菇菌盖上挖取组织后，切成厚度为2 mm厚的均匀薄片，称取该薄片2 g置于25 mL试管中，加入25 mL去离子水，在摇床上震荡30 min后，用电导率仪测定溶液电导率，记为P1（μs/cm）；再放入水浴锅煮沸10 min，加水到原刻度并冷却至室温，测定溶液电导率，记为P2（μs/cm）；测定去离子水电导率，记为P0（μs/cm）。按（4）式计算相对电导率P，表示果肉膜透性。

1.3.4 总酚含量测定

参考曹建康等[11]的方法。称取2 g菇肉，加入少许预冷后体积分数为1%的HCl-甲醇溶液，在冰浴条件下研磨匀浆后，转入20 mL刻度试管中，于4 ℃避光提取20 min，收集滤液，波长280 nm处测定溶液的吸光度值，对比吸光度（Y1）与没食子酸浓度（X1,μmol/g）的标准曲线：Y1=0.8734X1+0.013 4，R2=0.999 9，计算出每克果蔬组织的总酚含量（μmol/g）。

1.3.5 维生素C含量测定

参考曹建康等[11]的分光光度计法并有所改动。反应体系为1 mL提取液和1 mL浓度为50g /L的三氯乙酸溶液，测定并记录该体系在534 nm处的吸光度值，对照吸光度（Y2）与维生素C含量（X2,μg）的标准曲线：Y2=0.0098X2+ 0.027 6，R2=0.998 0，计算双孢菇中维生素C含量，以100 g鲜样所含的维生素C质量表示（mg/100 g）。

1.3.6 谷胱甘肽含量测定

参考曹建康等[11]的方法并有所改动。反应体系为1 mL上清液、1 mL pH值 7.7的磷酸缓冲液和0.5 mL 4 mmol/L二硫代硝基苯甲酸溶液，在25 ℃条件下保温反应10 min，测定其在波长412 nm处的吸光度，对照吸光度（Y3）与谷胱甘肽（Glutathione, GSH）含量（X3,μmol）的标准曲线：Y3=39.346X3-0.1201，R2=0.999 7，计算出谷胱甘肽的含量（μmol/g）。

1.3.7 相关酶活性测定

多酚氧化酶（Polyphenol oxidase, PPO）和过氧化物酶（Peroxidase, POD）活性的测定参照姜爱丽等[12]的方法；过氧化氢酶（Catalase, CAT）的测定参考曹建康等[11]的方法；谷胱甘肽还原酶（Glutathione reductase, GR）的测定方法参考Foyer等[13]的方法；抗坏血酸还原酶（Ascorbate peroxidase, APX）活性的测定参考Wang等[14]的方法，以上酶活测定分别以每克样品每分钟在相应波长下吸光值变化为1个酶活单位，结果以U/（g·min）表示。超氧化物歧化酶（Superoxidase dismutase, SOD）的测定参考Tang等[15]的方法，以每分钟每克鲜重果蔬组织的反应体系对氮蓝四唑光化还原的抑制为50%时为一个SOD活性单位，结果表示为U/（g·min）。

1.3.8 DPPH自由基清除率测定

DPPH自由基清除率的测定方法参照Wang等[16]的方法。

1.4 数据统计分析

采用Graphpad Prism8软件制图。采用 IBM SPSS statistics 20对数据进行分析，使用单因素方差分析法进行数据显著性分析，P＜0.05 表示差异显著；使用Pearson法进行数据相关性分析，所有数值均为3次平行测定的算术平均值。

2 结果与分析

2.1 振动时间对双孢菇表皮损伤及色泽的影响

由图1可知，贮藏3 d后，未进行振动处理的对照组双孢菇表皮上未发现明显的机械损伤，振动8 h处理组表皮出现轻微的摩擦褐变现象，振动处理16 h出现的局部摩擦褐变面积更大且褐变程度更深，振动处理24 h组的机械损伤范围最大并且褐变程度最深，说明振动处理时间越长对双孢菇造成的机械损伤越大。

双孢菇的色泽是影响消费者接受度的重要属性之一[17]，一般认为，亮度值L*在80以上的双孢菇会被绝大多数消费者接受[18]。由图2a可以看出，随着贮藏时间的增加双孢菇L*值减小，对照组的L*值下降速度小于振动处理组。贮藏3 d后，振动处理24、16和8 h的双孢菇L*值由初始时91.76急剧下降至82.15，85.90和85.30，而对照组双孢菇L*值则由初始时91.76缓慢下降至90.64，变化较为平缓。

BI值表示双孢菇表面的褐变程度，从图2b可以看出，经过振动处理的双孢菇色泽均随贮藏时间的增加褐变程度加大，并且振动处理组的BI值都高于对照组，振动时间越长，褐变程度越大，贮藏15 d后，振动24 h组的BI值为38.07，对照组的褐变指数为24.87，振动24 h组的BI值是对照组的1.53倍。

ΔE值表示双孢菇色泽与理想色泽变化程度，双孢菇ΔE值越高，褐变程度越大。由图2c可知，对照组的ΔE值始终比处理组低（P＜0.05），贮藏15 d后，对照组与振动处理8、16、24 h组的的ΔE值分别是：20.80、22.63、24.48和32.69，其中振动处理24 h组是对照组的ΔE值的1.57倍。

L*值和ΔE值的变化均表现出和BI值一致的结果，贮藏和振动处理时间越长，双孢菇的亮度越低，色泽变化越大，说明振动胁迫促进双孢菇表面色泽褐变，且振动处理时间越长表面褐变程度越高。

2.2 振动时间对细胞膜渗透率的影响

细胞膜能够维持细胞的微环境和正常代谢，膜透性的增加会导致细胞电解质外渗，细胞膜透性与膜的完整程度呈负相关[19]。由图3可知，贮藏过程中对照组和振动处理组细胞膜渗透率均呈上升趋势，振动时间越长细胞膜渗透率上升越快，其中振动处理组与对照组差异显著（P＜0.05），说明振动胁迫促进膜系统的破坏，加剧了细胞电解质外渗。

2.3 振动时间对非酶抗氧化物质含量的影响

酚类物质对双孢菇的采后品质主要有两方面的影响，一是作为重要的抗氧化物质，能够清除自由基，增强果蔬抗氧化功能[20]，再者是作为底物参与双孢菇的酶促褐变反应[21]。图4a结果表明，双孢菇总酚含量随贮藏时间延长呈下降趋势，振动处理时间越长总酚含量下降越快，振动处理6 d，对照组与振动处理8、16、24 h组的总酚含量分别为3.17、3.02、2.87和2.86μmol/g；当双孢菇贮藏到第15天时，对照组的总酚含量分别是振动处理8、16、24 h组的1.19倍、1.23倍和1.51倍，振动处理组与对照组存在显著差异（P＜0.05），说明振动胁迫增加了酚类物质的消耗，降低了双孢菇的抗氧化性。

抗坏血酸-谷胱甘肽循环是抗氧化系统的重要组成部分，与其他活性氧清除系统共同作用，清除体内的活性氧自由基，谷胱甘肽可将脱氢抗坏血酸还原生成维生素C，维生素C能够清除H2O2[22]，是重要的非酶抗氧化物质。图4b显示，最初维生素C含量为5.32 mg/100 g，振动处理并贮藏15 d后，对照组、振动处理8、16、24 h组的抗坏血酸含量分别降为2.45、2.25、2.00和1.82 mg/100 g，对照组与振动处理组维生素C含量差异显著（P＜0.05）。由图4c可知，贮藏15 d后对照组和振动处理8、16、24 h组GSH含量由试验最初的7.00μmol/g，分别降至2.48、2.20、1.81和1.30μmol/g，其中对照组与贮藏16、24 h组差异显著（P＜0.05）。试验研究结果表明振动处理会加速维生素C和GSH这类非酶抗氧化物质的消耗，并且振动处理时间越长含量越低，这与李洋等[19]研究振动胁迫对蓝莓品质的影响得到的结果是一致的。

2.4 振动时间对抗氧化酶活性的影响

2.4.1 振动时间对PPO和POD的影响

多酚氧化酶可以使单酚羟基转化为邻苯二酚，也可以催化邻苯二酚氧化成为醌类物质，这种醌类物质不稳定，容易进一步形成黑色素，是双孢菇酶促褐变和品质劣变的主要原因之一[23]。如图5a所示，随着贮藏时间的延长，双孢菇PPO活力逐渐增强，贮藏6 d，对照组和振动处理8、16、24 h组PPO酶活分别为5.15、6.21、6.58和7.54 U/(g·min)，对照组PPO酶活显著低于其他各振动处理组（P＜ 0.05），且增长速度较为平缓，这说明振动胁迫使PPO酶活加大，振动处理时间越长，PPO酶活上升越快。

POD既能清除过氧化氢和脂类氢过氧化物，在活性氧代谢系统中起重要作用；也能催化类黄酮、酚类物质的氧化和聚合，导致组织褐变[24]。由图5b可以看出，各组POD酶活都在贮藏3 d后到达峰值，总体趋势为先上升后下降，相对来讲，振动处理组POD酶活上升更加急剧，下降也更快，对照组的POD酶活变化则比较平缓，在贮藏到第9天以后，对照组POD酶活大于振动处理组（P＜0.05）。

2.4.2 振动时间对SOD和CAT的影响

SOD和CAT是果蔬衰老过程中的保护酶，通过清除细胞内活性氧而增强细胞抗氧化性[25]，SOD将超氧阴离子分解为H2O2，再进一步由CAT将H2O2分解为水和氧气[26]。图6a显示，各组双孢菇在贮藏期间SOD活性先增加后降低。对照组处理的SOD活性变化较为平缓，振动处理组前期活性较高，可能是因为振动胁迫刺激了双孢菇的抗逆反应，增高了SOD活性，贮藏3 d后振动处理组SOD酶活迅速下降，9 d后低于对照组SOD酶活（P＜0.05）；如图6b所示，各组双孢菇CAT活性在贮藏期间呈下降趋势，对照组CAT酶活始终高于振动处理组（P＜0.05），且振动处理时间越长CAT活性下降越快。

2.4.3 振动时间对GR和APX的影响

谷胱甘肽还原酶（GR）和抗坏血酸还原酶（APX）是抗坏血酸-谷胱甘肽循环中的重要组成部分，GR能将氧化型谷胱甘肽还原成GSH，而GSH在APX的作用下将脱氢抗坏血酸还原成还原性抗坏血酸[27]。由图7a可知，各组双孢菇在贮藏期间GR酶活逐渐降低，其中对照组GR酶活始终高于振动处理组（P＜0.05），且振动处理越久，GR酶活下降越快，贮藏15 d，对照组GR酶活是振动24 h组的2.37倍。由图7b可知，APX酶活呈现先上升后下降的趋势，振动处理组在第3天到达峰值，而对照组在第6天才到达峰值，说明振动胁迫促进了双孢菇APX酶活峰值提前到来，第6天之后，对照组APX酶活始终高于振动处理组（P＜0.05）。

2.5 振动时间对DPPH自由基清除率的影响

双孢菇采后衰老与活性氧的代谢平衡密切相关。植物代谢过程会产生自由基，引起生物大分子物质的氧化损伤，同时自由基的积累会损伤组织细胞膜，引起代谢紊乱[28]。DPPH是一种稳定的自由基，广泛用于测定抗氧化剂清除自由基的能力[29]。由图8可以看出，双孢菇DPPH自由基清除能力随振动处理时间增加而降低，贮藏15 d，对照组和振动处理8、16、24 h组的DPPH清除率分别是82.39%、81.34%、80.36%和79.86%，振动处理24 h组与对照组差异显著（P＜0.05）。

2.6 不同振动时间双孢菇贮藏期间不同指标间的相关性分析

由表1数据可知，双孢菇褐变指标、抗氧化相关酶指标和非酶抗氧化物质相互间大部分呈高度相关（P＜0.01），表明双孢菇的褐变程度与抗氧化性密切相关，抗氧化能力越强则褐变程度越低，其中维生素C、GSH含量与L*值、BI值以及ΔE值均呈极显著相关（P＜0.01），说明维生素C和GSH含量是双孢菇受振动胁迫后褐变的关键指标。PPO、CAT、SOD、GR酶活与BI呈显著或极显著相关，其中POD和APX主要在贮藏中期发挥抗氧化作用，在贮藏前期和后期的抗氧化能力较弱，因此其酶活呈现先上升后下降的趋势，而褐变相关指标都呈现为单调下降或上升的趋势，造成POD、APX与褐变指标相关性不显著。

表1 振动胁迫对双孢菇贮藏品质影响的相关性分析Table 1 Correlation analysis of effects of vibration stress on storage quality of Agaricus bisporus

3 讨 论

双孢菇菌盖颜色变化在采后主要表现为褐变，是影响其品质最大且最为直观的指标之一，细胞膜渗透率通过电解质外渗程度反映组织的衰老程度[30]。本试验结果显示，双孢菇在振动处理后菌盖表面迅速褐变，之后变化较为平缓，说明振动胁迫对双孢菇褐变影响较大，原因是其外表保护层较为脆弱，模拟运输过程中菇体之间发生摩擦，造成表皮机械损伤，引起受伤组织周围的细胞产生更多酚类[21]，增加的酚类物质可参与组织的愈伤过程，同时也在多酚氧化酶的作用下生成黑色物质。另外观察发现，振动导致了双孢菇外表皮较严重的机械损伤，这个结果启示我们可以通过增加缓冲包装减少机械损伤，从而提高双孢菇的品质。

总酚、维生素C和GSH是植物体内重要的非酶抗氧化物质，本试验中含量均随贮藏时间增加而下降，维生素C变化趋势与许时星等[9]研究振动胁迫对蓝莓贮藏品质时的结果一致，但蓝莓中总酚含量先升后降，与本试验结果有所不同，推测原因是蓝莓尚未达到后熟阶段，前期总酚含量上升，而本试验双孢菇已接近后熟，因此没有出现前期总酚含量上升的情况，这与陶菲[31]的研究结果一致。

SOD、CAT、GR和APX都是抗氧化酶。本试验中SOD和APX酶活呈先上升后下降的趋势，这与谢丹丹[32]研究振动胁迫对猕猴桃生理品质的影响结果一致，贮藏一段时间后，对照组酶活大于振动处理组，而振动处理组贮藏前期酶活峰值大于对照组是双孢菇应对外界胁迫的一种逆境反应。GR和CAT酶活变化呈总体下降趋势，且对照组的酶活始终大于振动处理组，说明振动胁迫降低了双孢菇的抗氧化性能，这点也通过DPPH自由基清除率的变化趋势表现出来。

对上述指标进行相关性分析，结果显示大多数褐变指标与抗氧化指标呈极显著相关，推测双孢菇在振动胁迫的逆境条件下，由于机械损伤或者振动本身导致其原本的活性清除机制平衡被打破。SOD、APX等抗氧化酶在一段时间内为应对逆境活性升高，以清除由于振动胁迫出现过多的自由基；CAT、GR等抗氧化酶则表现为活性降低，从而引起自由基的积累和膜脂过氧化，膜系统被破坏，各个系统之间相对独立的状态被打破；PPO与酚类物质相结合，产生黑色物质，引起双孢菇褐变，最终影响营养和商品价值。事实上，许多抗氧化物质直接参与双孢菇的褐变进程，例如维生素C作为一种强还原剂，既是一种抗氧化物质也可以用作护色剂；POD既能够作为抗氧化酶清除过氧化氢，也能够催化类黄酮和酚类物质生成黑色物质。

4 结 论

1）本试验研究了不同振动时间对双孢菇贮藏品质的影响，结果显示振动胁迫对双孢菇采后采后的损伤是逐渐累积的，振动时间越久贮藏品质劣变越快，应当将运输时间控制在合理范围内，避免运输时间过长。

2）分析不同振动时间对双孢菇表皮损伤情况发现，运输振动会对双孢菇表皮造成机械损伤，振动时间越长，菇盖表皮摩擦机械损伤越大且褐变程度越深，应当采取措施减少固体之间的摩擦，减少运输过程中的机械损伤。

3）通过分析各个指标间的相关性，发现双孢菇的褐变程度与非酶抗氧化物质含量（维生素C、GSH、总酚）、抗氧化酶活性（PPO、SOD、CAT和GR）以及DPPH自由基清除率等抗氧化指标密切相关，抗氧化能力下降越快，则其褐变程度越深，这表明可以通过维持双孢菇的抗氧化能力从而保持贮运品质。

综上所述，双孢菇实际运输过程中，应当避免运输时间过长的情况，减少菇体受到的机械损伤，并通过技术手段维持其抗氧化系统正常运转，如采用低温冷藏运输或者使用缓冲包装减少运输途中菇体的相互碰撞，减缓采后衰老并降低机械损伤，从而保持双孢菇的贮运品质。