可可碱体外抗氧化活性的研究

吴秀仪， 黄 和， 曹湛慧， 伍 樱， 黄君梅， 程舒婕， 陈泳恩

（ 广东海洋大学 食品科技学院， 广东 湛江 524088）

可可（ Cacao） ， 原产于美洲热带的常绿乔木，属梧桐科， 在赤道南北纬10 °以内的热带地区广泛种植， 与咖啡、 茶叶一起并称为世界三大软饮料。可可的果实为可可豆， 是巧克力生产的主要原材料，广泛应用于甜点、 饮料、 乳制品、 糖果等食品行业，其浓郁芳香的独特味道深受人们喜爱。 可可豆中主要活性物质为多酚类化合物（ 占5%～15%） 、 生物碱（主要为可可碱和咖啡碱， 占3%～6%）、 矿物质（ 如K、 Ca、 Mg 等）、 维A、 维B、 维E 等。

可可碱（Theobromine； 化学式： 3,7- 二氢-3,7-二甲基-1H- 嘌呤-2,6- 二酮） 是可可中含量最多的生物碱， 含量约为1.5%。 目前， 可可碱主要应用于临床效用， 现有相关文献表明， 己酮可可碱有治疗短暂性脑缺血症状、 增强精子活力、 辅助治疗糖尿病[1-2]等功效。 此外， 有关可可碱的其他生物活性和实际应用的报道较少见。

以可可豆为原料， 通过乙醇回流法提取可可碱粗提物， 采用大孔树脂对粗提物进行纯化， 研究可可碱粗提物及纯化物的抗氧化活性。 从总还原能力及对3 种自由基（ 二苯代苦味肼基自由基、 羟基自由基、 超氧阴离子自由基） 的清除能力评价可可碱的抗氧化能力， 进一步探索可可碱利用价值， 为可可碱的综合利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

可可豆， 采摘于海南兴隆的中国热带农业科学院香饮研究所可可种植基地。

可可碱标准品， 上海安谱实验科技股份有限公司提供， 纯度99%； LS-303 型大孔吸附树脂， 陕西蓝深特种树脂有限公司提供； 盐酸、 三氯乙酸、 过氧化氢、 无水乙醇、 铁氰化钾、 水杨酸、 硫酸亚铁、三羟甲基氨基甲烷、 焦性没食子酸等， 均为分析纯。

1.2 仪器与设备

LC-20AD 型高效液相色谱仪， 日本岛津公司产品； HH-6 型数显恒温水浴锅， 国华电器有限公司产品； BT100-8 型数显恒流泵， 上海青浦泸西分析仪器厂产品； BS-100A 型电脑全自动部分收集器， 上海青浦泸西分析仪器厂产品； RE-2000A 型旋转蒸发仪， 上海亚荣生化仪器厂产品； 722 型可见光分光光度计， 上海仪电分析仪器有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 可可豆预处理

将可可豆清洗干净后剥壳取出果实， 将其烘干、粉碎， 过50 目筛， 得到可可粉， 于冰箱中4 ℃下避光保藏。

1.3.2 可可碱粗提物的提取

取适量可可豆粉， 利用乙醇回流法提取可可粉中的可可碱。 从料液比、 提取时间、 乙醇体积分数3 个方面设计单因素试验， 得出乙醇回流法提取可可粉中的可可碱较佳的工艺条件为料液比1∶50， 提取时间60 min， 乙醇体积分数30%。 结合单因素试验的结果进一步设计L9（ 34）正交试验， 通过极差分析、方差分析及最终的验证试验， 得出可可碱提取的最佳工艺条件为料液比1∶60， 提取时间60 min， 乙醇体积分数30%。 采用正交试验得出的最佳工艺条件提取可可碱， 得到可可碱粗提物。

1.3.3 可可碱粗提物的纯化

将提取出来的可可碱粗提物经旋转蒸发仪减压浓缩后， 利用LS-303 型大孔树脂纯化可可碱粗提物。 首先， 对大孔树脂进行预处理。 先用95%乙醇溶液浸泡树脂24 h 去除其中杂质， 然后进行湿法装柱， 继续用95%乙醇淋洗， 直至洗出液变清澈且不出现白色浑浊， 最后用蒸馏水继续淋洗至无明显乙醇气味。 参考杨军国等人[3]富集咖啡碱的方法并加以改进， 准确称取200 g 处理过的LS-303 型大孔树脂（ 湿重） ， 湿法装柱， 用蒸馏水平衡树脂12 h， 使树脂填充紧密， 不得出现气泡与分层， 否则重新装柱。取100 mL 经旋转蒸发浓缩后的可可碱粗提物溶液以1 mL/min 的吸附速度上柱。 待树脂完全吸附饱和后，用20%乙醇溶液作为洗脱剂以1 mL/min 的流速进行可可碱的解吸附。 洗脱剂的上柱速度与洗脱液的流出速度相等。 每隔3 min 收集一次洗脱液， 每管体积为3 mL， 一共收集80 管。 通过高效液相色谱仪测定分析各小管中洗脱液的可可碱含量， 绘制动态洗脱曲线， 将可可碱含量较高的几管合并， 作为最终纯化物。 最终测得同体积下， 经过大孔树脂纯化后的可可碱质量浓度为纯化前的3.31 倍。

1.3.4 可可碱含量的测定

取可可碱标准品用乙醇溶解配制成梯度质量浓度的标准溶液， 用于制作标准曲线来确定样品中可可碱含量。 利用高效液相色谱仪测定可可碱的含量，并记录下不同质量浓度的标准溶液的峰面积， 根据数据绘制得到可可碱标准曲线， 得到标准曲线的线性回归方程和R2。

参考卢金清等人[4]建立的可可碱高效液相色谱（HPLC） 含量测定方法， 高效液相色谱仪器条件为：用型号为Agilent ZORBAX Extend-C18（ 250 mm×4.6 mm， 5 μm） 的色谱柱， 以乙腈- 水（ 体积分数为20%～80%） 作为流动相， 进行等度洗脱， 流速为0.8 mL/min， 检测波长为275 nm， 柱温为30 ℃。

将可可碱提取物以转速3000 r/min 离心10 min，过滤， 将滤液转至100 mL 容量瓶中以相对应的溶剂定容。 取5 份定容后的溶液分别用高效液相色谱仪测定提取物可可碱的含量。

1.3.5 抗氧化试验

配制质量浓度为0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0 mg/mL的可可碱粗提液及纯化液（ 以可可碱含量计） ， 作为待测样品溶液， 同理配制质量浓度为0.2， 0.4， 0.6，0.8， 1.0 mg/mL 的维C 溶液（ 以维C 含量计） 作为对照组， 同一条件下与待测样品溶液共同进行抗氧化试验， 每组试验平行进行3 次， 结果取平均值。

（1） 总还原能力的测定。 参考文献[5]的方法进行可可碱粗提液和纯化液的总还原能力的测定。 于10 mL 比色管中加入不同浓度的样品溶液1 mL、0.2 mol/L 的pH 值6.6 磷酸缓冲盐溶液2.5 mL、 1%铁氰化钾溶液2.5 mL， 摇匀后于50 ℃恒温水浴锅中反应20 min， 冷却后滴入10%三氯乙酸溶液2.5 mL 使反应终止， 将混合溶液置于离心机中以转速3 000 r/min离心10 min， 另取干净的比色管放入离心后的上清液2.5 mL、 0.1%三氯化铁溶液0.5 mL、 蒸馏水2.5 mL，混合均匀后静置反应10 min。 最后以蒸馏水为参照，于波长700 nm 处测定吸光度。 用吸光度的高低来衡量样品溶液的还原性强弱， 吸光度越高， 样品溶液的总还原能力越高。

（2） 二苯代苦味肼基自由基（ DPPH·） 清除率的测定： 参考文献[5]的方法测定可可碱粗提液及纯化液的清除DPPH·自由基能力。 取3 mL 不同浓度的样品溶液、 0.2 mmol/L 的DPPH 溶液3 mL 混合均匀， 于黑暗处避光反应30 min， 以无水乙醇为参照， 于波长512 nm 处测定吸光度Ai。 同时， 以样品溶液3 mL 与无水乙醇混合液3 mL 作为本底组，测定其吸光度Aj， 排除样品溶液本身颜色影响； 并取0.2 mmol/L 的DPPH 溶液3 mL 与无水乙醇混合液3 mL 作为空白组， 测定其吸光度A0。 以维C 为阳性对照， 样品溶液对DPPH 自由基的清除率（R1）按下式计算。

（ 3） 羟基自由基（·OH） 清除率的测定： 参考文献[6]的方法测定可可碱粗提液及纯化液的清除OH自由基能力。 于比色管中加入10 mmol/L 水杨酸- 乙醇溶液（ 现配现用） 、 10 mmol/L 硫酸亚铁溶液（ 现配现用）、 样品溶液各1 mL， 再加入0.03%过氧化氢溶液1 mL 启动反应， 混匀后置于37 ℃水浴锅中反应30 min， 最后将反应溶液于波长510 nm 处测定吸光度Ai。 同时， 取10 mmol/L 水杨酸- 乙醇溶液、10 mmol/L 硫酸亚铁溶液、 待测样品溶液、 无水乙醇各1 mL 混合均匀后测定吸光度值， 作为本底组吸光度Aj；并取10 mmol/L 水杨酸- 乙醇溶液、 10 mmol/L 硫酸亚铁溶液、 蒸馏水、 0.03%过氧化氢溶液各1 mL 混合均匀后测定吸光度值， 作为空白组吸光度A0。 以维C为阳性对照， 样品溶液对OH 自由基的清除率（R2）按下式计算。

（4） 超氧阴离子（O2-·） 自由基清除率的测定：参考文献[7]的方法测定可可碱粗提液及纯化液的清除O2-自由基能力。 于比色管中放入50 mmol/L的pH 值8.2 Tris-HCl 缓冲溶液4.5 mL、 样品溶液1 mL， 置于25 ℃水浴锅中保温10 min， 滴入25 mmol/L 邻苯三酚溶液0.3 mL（ 现配现用） ， 继续于25 ℃中保温5 min， 滴入1～2 滴浓盐酸终止反应， 最后将反应溶液于波长325 nm 处测定吸光度Ai。 同时， 用蒸馏水1 mL 代替样品溶液进行上述反应， 作为空白对照，测得吸光度A0。 以维C 为阳性对照， 样品溶液对O2-自由基的清除率（R3）按下式计算。

1.3.6 试验数据与处理

所有数据是3 次平行试验结果的平均值， 数据均利用SPSS 软件进行整理分析， 利用Origin 2017 软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 可可碱标准曲线

以梯度质量浓度的可可碱标准品做出标准回归曲线， 所得曲线方程为Y=21 926X+6 751.2， 相关系数R2=0.999 9， 具有较高的可信度。 据色谱图可得，保留时间为6.45 min 时， 可可碱有特征吸收峰。

可可碱标准曲线见图1， 可可碱标准品色谱图见图2。

图1 可可碱标准曲线

图2 可可碱标准品色谱图

2.2 抗氧化试验结果

2.2.1 总还原力的比较

各样品溶液总还原能力的比较见图3。

图3 各样品溶液总还原能力的比较

该方法是基于氧化还原反应的比色法， 以样品溶液对Fe3+的还原能力作为总还原能力。 由图3 可知， 在0.2～1.0 mg/mL 的范围内， 纯化前后的可可碱及维C 的总还原能力均随着质量浓度的增大而增强。总体来说， 可可碱纯化液的总还原能力比粗提液强。当可可碱纯化液的质量浓度为1.0 mg/mL 时， 平均吸光度达到1.289， 同一质量浓度下的维C 的平均吸光度为1.303， 二者十分接近， 说明可可碱纯化液具有良好的总还原能力。 粗提液的总还原能力不及纯化液和维C， 最大质量浓度的粗提液的平均吸光度仅为0.999。

2.2.2 对1,1- 二苯基- 2- 苦肼基（DPPH·） 清除能力的比较

各样品溶液对DPPH·清除能力的比较见图4。

图4 各样品溶液对DPPH 清除能力的比较

DPPH·的乙醇溶液呈紫色， 且在特定波长下有强吸收。 抗氧化剂容易与DPPH·的孤对电子配对，从而造成DPPH·减弱或消失， 因此通过DPPH·的浓度变化可计算样品对DPPH·的清除率。 利用SPSS 软件， 对数据进行线性模拟， 计算出三者对DPPH·的半抑制浓度IC50用来比较三者清除DPPH·的能力。计算得出， 可可碱纯化液的IC50为0.343， 粗提液为0.562， 维C 为0.23， 即三者对DPPH·的清除能力由高到低排序为维C＞可可碱纯化液＞可可碱粗提液。 当质量浓度为1.0 mg/mL 时， 维C 的清除率达98.53%， 纯化液的清除率达80.35%， 而粗提液仅为72.48%。 其中， 纯化液的清除率与质量浓度具有较好的线性关系， 说明其对DPPH·的清除能力较好。

2.2.3 对羟基自由基（·OH） 清除能力的比较

各样品溶液对羟自由基清除能力的比较见图5。

图5 各样品溶液对羟自由基清除能力的比较

利用Fenton 反应， 即H2O2与Fe2+混合反应生成·OH， 水杨酸能够捕捉·OH 并产生有色物质， 该物质在特定波长下有最大吸收， 根据样品与水杨酸的竞争可计算出样品的清除率。 计算得出， 维C、 可可碱纯化液、 粗提液对羟自由基的半抑制浓度IC50值分别为0.231， 0.402， 0.652。 故三者对羟自由基的清除能力由高到低排序为维C ＞可可碱纯化液＞可可碱粗提液。 当质量浓度为1.0 mg/mL 时， 维C 的清除率达98.82%， 纯化液的清除率达97.03%， 二者比较接近， 而粗提液仅为76.04%。

2.2.4 对超氧阴离子自由基（O2-·） 清除能力的比较

各样品溶液对超氧阴离子清除能力的比较见图6。

图6 各样品溶液对超氧阴离子清除能力的比较

在碱性条件下， 邻苯三酚容易发生自氧化反应生成O2-·， 而O2-·是一种能够促进邻苯三酚自氧化的有色的中间产物， 因此测定样品对其自氧化抑制作用即可测定对O2-·的清除能力。 计算得出维C、 可可碱纯化液、 可可碱粗提液对超氧阴离子的半抑制浓度IC50分别为0.311， 0.458， 0.448。 因此， 维C 对超氧阴离子的清除能力强于可可碱粗提液及纯化液， 而粗提液与纯化液的清除能力较为相近。 当质量浓度为1.0 mg/mL 时， 维C 的清除率最高， 达到99.17%； 纯化液达到89.62%， 粗提液达到80.99%。

3 结论

通过乙醇回流法提取可可碱粗提物， 采用大孔树脂对粗提物进行纯化， 研究可可碱粗提物及纯化物的抗氧化活性。 结果表明， 可可碱具有总还原能力及对3 种自由基清除能力。 当可可碱质量浓度为0.2～1.0 mg/mL 时， 其自由基清除能力与可可碱浓度呈良好的线性关系， 其中可可碱对DPPH 自由基的清除能力最好（ IC50为0.343） ， 其次为羟基自由基（IC50为0.402） 和超氧阴离子自由基（IC50为0.458） 。因此， 可可碱具有较好的抗氧化活性， 可作为天然抗氧化剂使用。