加热卷烟评估：加热卷烟烟支废弃物浸出液的环境风险

严大为，郭丹丹，莫俊超，舒耀皋*，郑赛晶*

1.上海新型烟草制品研究院，上海市浦东新区秀浦路3733号201315

2.上海化工院检测有限公司，上海市普陀区云岭东路345号200062

3.上海化学品公共安全工程技术研究中心，上海市普陀区云岭东路345号200062

近年来，加热卷烟的出现给烟草消费者提供了一种新的获取烟碱的途径。加热卷烟主要通过加热再造烟叶烟丝的方式释放含有烟碱的气溶胶［1-2］。与传统卷烟相比，加热卷烟气溶胶中含有的有害成分较少［3］。使用过后的加热卷烟烟支废弃物含有过滤嘴、卷烟纸和加热过的再造烟叶烟丝，这与传统卷烟烟蒂具有一定的相似性。当前对加热卷烟的风险评估研究多集中于加热卷烟气溶胶的健康风险评估和室内空气中烟气关注成分的残留研究，对加热卷烟烟支废弃物浸出液的研究报道相对较少［4-5］。因此，研究了加热卷烟烟支废弃物浸出液在生态环境中的水生生物急性毒性、陆生生物急性毒性、固有生物降解性和生物蓄积性，旨在为加热卷烟烟支废弃物浸出液的环境风险评估提供数据和方法参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

热卷烟烟支废弃物（某品牌境外市售加热卷烟，实测气溶胶中释放量：烟碱0.7 mg/支、焦油28 mg/支），采用加拿大深度抽吸方法（抽吸参数：抽吸体积55 mL、抽吸间隔30 s、抽吸持续时间2 s），用吸烟机抽吸后获得加热卷烟烟支废弃物。按照化学品测试指导原则中生物系统效应部分的要求配制实验中需要的ISO稀释水、Elendt M4培养基、活性污泥培养基和实验用人工土壤等［6］。

甲醇（色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司）。

Multitron Pro全功能振荡培养箱（瑞士Infors HT公司）；CL8R型超大容量冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）、CX21型生物显微镜（日本Olympus公司）；Multi 3420型便携式水质分析仪（德国Xylem公司）；ME204E型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KBF-LQC 720人工气候箱（德国Binder公司）；HI99121型便携式土壤酸度计（意大利Hanna公司）；DGG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器）；PF-8000型呼吸仪系统（美国RSA公司）；multi N/C 2100型TOC/TN仪（德国Analytik Jena公司）；1290/AB QTRAP4500型液质联用仪（美国Agilent/AB公司）；KQ-500DV型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；H2050R型离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；0.22 μm水相、0.22 μm有机相滤膜（上海安谱实验科技股份有限公司）。

1.2 受试生物

使用OECD实验导则推荐的受试生物：羊角月 牙 藻（Pseudokirchneriella subcapitata）、大 型 溞（Daphnia magna Straus）、斑 马 鱼（Brachydanio rerio）、赤子爱胜属蚯蚓（Eisenia foetida）和活性接种物（接种物均采自上海市，具体地点为宝山区湄浦河、吴淞码头、吴淞污水处理厂、泗塘生活污水处理厂、嘉定区顾浦河、嘉定区吴淞江、青浦区朝阳河、松江区新中河、闵行区俞塘河、普陀区长风公园中心湖的新鲜地表水、表土和活性污泥的混合物，实验开始前共驯化65 d，平均浓度为3 640 mg悬浮固体/L）。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制方法

溶液配制方法参考OECD化学品测试准则［7］和文献［6］中的化学品测试方法，并根据加热卷烟烟支废弃物的特点进行了适当改进。具体为：取32支加热卷烟烟支废弃物加入到2 L的OECD培养基（或稀释水）中，在200 r/min转速下机械搅拌24 h；静置2 h后，3 000 r/min离心10 min，取上清液过水相滤膜，得到浓度为16支/L的实验溶液。后续依次用培养基（或稀释水）按1∶1的比例稀释，得到所需浓度的实验溶液。

1.3.2 羊角月牙藻生长抑制实验

在正式实验前先开展了预实验以获取实验浓度范围，根据羊角月牙藻预实验结果，正式实验浓度 设 置 为0.125、0.250、0.500、1.00、2.00、4.00和8.00支/L等7个浓度梯度。同时采用OECD培养基作为空白对照组，空白对照组设置6个平行，各浓度组分别设置3个平行。每个平行的实验溶液体积为100 mL，摇匀后放入全功能振荡培养箱中进行培养，培养箱温度设置为23℃，连续光照强度为5 860~6 190 Lux，光质为白光，振荡方式为连续振荡（100±10）次/min，实验溶液的初始羊角月牙藻细胞浓度为1×104个/mL。实验观察期为72 h，采用显微镜细胞计数法测定羊角月牙藻的细胞浓度。每隔24 h测定羊角月牙藻的细胞浓度，每隔72 h观察藻细胞的生长情况［6-7］。

1.3.3 大型溞急性活动抑制实验

在正式实验前先开展了预实验以获取实验浓度范围，根据大型溞预实验结果设定正式实验浓度，正式实验浓度为0.125、0.250、0.500、1.00、2.00和4.00支/L。实验溶液配制方法同1.3.1节。先配制母液，后用ISO稀释水将母液等梯度逐级稀释得到各浓度的验溶液。同时进行空白对照组实验，对照组和处理组各设4个平行。每个平行的实验溶液体积为20 mL，置于100 mL玻璃烧杯中用于测试。每个平行放5只大型溞，每组共用20只大型溞。实验在温度为18~22℃、光照强度1 127~1 279 Lux的Binder人工气候箱中进行，每天光照16 h。实验开始时和结束后，测定空白对照组和浓度组的pH、溶解氧和温度，并在24和48 h时记录大型溞受抑制的数量及中毒症状。

1.3.4 斑马鱼急性毒性实验

在正式实验前先开展了预实验以获取实验浓度范围，根据斑马鱼预实验结果，正式实验共设4个浓度组进行实验，分别为0.500、1.00、5.00和15.0支/L，同时进行空白对照实验，实验不设平行，每个处理组7尾斑马鱼。采用流水式的动态暴露方式进行染毒暴露，每组实验溶液的体积为2 L，实验周期为96 h。在实验开始后3、6、24、48、72及96 h观察记录实验鱼的死亡及中毒症状情况，并记录任何明显的异常现象（如平衡能力、游泳行为、呼吸功能、色素沉积等方面异常）。

1.3.5 蚯蚓急性毒性实验

在正式实验前先开展了预实验以获取实验浓度范围，根据蚯蚓急性毒性预实验结果，正式实验采用限度实验，限制浓度为每千克（干质量）人工土壤中60支加热卷烟烟支废弃物，同时设置空白对照组。每个处理组设4个平行，每个平行10条蚯蚓。空白对照组不添加加热卷烟烟支废弃物浸出液，其他处理相同。母液配制过程与同1.3.1节，配制完成后，取150 mL母液与500 g人工土壤混合，并机械搅拌后再手拌混匀。充分搅拌均匀后，测定土壤的含水量和pH。将处理土壤分别转入实验容器中，清洗干净的蚯蚓单独称量，放在土壤表面，蚯蚓在短时间内钻入人工土壤。用扎好小孔（不少于8个）的保鲜膜覆盖在容器上以防实验介质变干；放入温度为（20±2）℃，相对湿度为（80±15）%的人工气候箱内，位置随机。实验第7天，将实验容器内的实验土壤轻轻倒入托盘中，取出蚯蚓，查看其存亡情况（检验不动蚯蚓尾部对针刺的反应），观察记录各实验容器中蚯蚓显著的体征病理变化或显著行为变化。检查结束后，将实验介质和蚯蚓重新置于实验容器内继续培养。第14天时再查看蚯蚓的死亡情况和毒性症状。实验结束时测定存活蚯蚓的体质量和各实验容器中土壤含水量。

1.3.6 固有生物降解实验

固有生物降解实验时，加热卷烟烟支废弃物浸出液的浓度为0.25支/L。取250 mL该浸出液加入到反应瓶中，再取27.470 mL活性污泥加入到反应瓶中，最后加入活性污泥培养基至总体积为1 L，处理组设置3个平行。设置空白对照组和程序对照组，其中空白对照组的反应瓶中仅加活性污泥和活性污泥培养基，程序对照组的反应瓶中加入10.00 mL苯胺溶液（浓度为10 000 mg/L），其余实验过程与处理组相同。测定pH并密封反应瓶后，将各反应瓶放入呼吸仪，以320 r/min的转速进行搅拌，开始测定氧消耗量。实验期间每天检查温度和搅拌状况，并读取耗氧量数据，根据实际耗氧量和理论需氧量的比值，计算固有生物降解率。

1.3.7 鱼类富集实验

在正式实验前先开展了预实验以获取实验浓度范围，根据加热卷烟烟支废弃物浸出液的斑马鱼急性毒性实验结果和实验样品定量方法的检出限，生物富集实验的加热卷烟烟支废弃物浸出液浓度设为0.05和0.50支/L，同时设置空白对照。对照组和处理组均设2个平行组，每组40条斑马鱼。采用流水式实验装置，将斑马鱼暴露在动态的实验溶液中8 d，于第0、24、48、96、144和192 h时采集鱼样，每次取5尾鱼，取出鱼样后快速冲洗并吸干表面水分，低温冷冻3~5 min致其死亡后，将同一浓度处理组的鱼样合并后称量，然后进行预处理。斑马鱼样的预处理方法为：称量鱼样后，称取硅藻土补至8 g，一并导入研钵中研磨充分后，转入60 mL密闭离心管中，加入15 mL甲醇，密闭超声提取30 min后，5 000 r/min离心20 min，取上清液，重复提取3次，合并上清液后定容至50 mL，过有机相滤膜后转入进样瓶中进行检测。同时实验开始后每天采集暴露水样，分别从容器的上、中、下层各取10 mL溶液，合并于三角瓶中，混匀，取2 mL过水相滤膜后，转入色谱进样瓶中，进行烟碱浓度检测。

1.4 统计分析

羊角月牙藻生长抑制实验、大型溞急性活动抑制实验和斑马鱼急性毒性实验使用ToxRat Pro（Version 3.3.0）对结果进行统计分析。固有生物降解实验采取公式（1）计算降解率［6］，生物富集性实验的富集系数为鱼体中烟碱浓度和水体中烟碱浓度的比值。

式中：BOD—供试品生化需氧量，mg；B—接种物对照组氧气消耗量，mg；TOD—供试品完全被氧化所需的理论耗氧量，mg。

2 结果与分析

2.1 羊角月牙藻生长抑制实验结果

羊角月牙藻在不同浓度的处理组中，生长率出现明显差异。加热卷烟烟支废弃物浸出液的浓度越高，羊角月牙藻的生长抑制现象越明显。根据羊角月牙藻细胞浓度测定结果，计算空白对照组和各浓度组的平均特定生长率，以及以特定生长率为基础的抑制率。通过计算得到实验样品对藻类生长72 h的半数生长抑制效应浓度（Effect concentration of 50% inhibition of growth rate，ErC50）为1.843支/L，95%置信区间为1.522~2.210支/L（表1）。

表1 加热卷烟烟支废弃物浸出液对羊角月牙藻生长抑制率的影响（均值±标准差）Tab.1 Effects of extracts from used HTP butts on growth inhibition rate of Raphidocelis subcapitata（mean±SD）

2.2 大型溞急性活动抑制实验结果

大型溞暴露在0.125支/L低浓度的加热卷烟烟支废弃物浸出液中受抑制率较低，但是随暴露浓度增加，逐渐出现游泳变快、画圈游动、附肢可动和有附着物结团等情况，甚至在4支/L的高浓度情况下大型溞的活动完全受到抑制，48 h的累积受抑制率达100%。实验处理组的累积受抑制数和受抑制率见表2。通过计算得出加热卷烟烟支废弃物浸出液对大型溞的急性活动抑制毒性24 h的EC50值 为1.481支/L，95%置 信 区 间 为1.195~1.843支/L；48 h的EC50值为0.665支/L，95%置信区间为0.601~0.736支/L。

表2 加热卷烟烟支废弃物浸出液对大型溞累积受抑制率的影响①Tab.2 Effects of extracts from used HTP butts on accumulation inhibition rate of Daphnia magna

2.3 斑马鱼急性毒性实验结果

在96 h暴露期内，空白对照组、加热卷烟烟支废弃物浸出液浓度为0.5和1.0支/L处理组中斑马鱼未表现出中毒症状，但浓度为5.0支/L的处理组斑马鱼在暴露6 h后出现游泳异常，24 h后全部中毒死亡。浓度为15.0支/L的处理组斑马鱼在暴露3 h后全部死亡（表3）。根据最终的实验结果，采用二项式法进行计算，加热卷烟烟支废弃物斑马鱼的96 h半数致死浓度（LC50）值为2.236支/L，98.4%的置信区间为1.0～5.0支/L。

表3 加热卷烟烟支废弃物浸出液对斑马鱼累积死亡率的影响Tab.3 Effects of extracts from used HTP butts on cumulative mortality of zebrafish

2.4 蚯蚓急性毒性实验结果

蚯蚓暴露在含有加热卷烟烟支废弃物浸出液的人工土壤14 d后，蚯蚓的存活、体质量和行为均未发生明显异常。实验暴露期结束后，未发现任何处理组蚯蚓出现中毒或死亡（表4）。根据蚯蚓急性毒性实验的观察结果，在设置的限制浓度下，加热卷烟烟支废弃物浸出液对蚯蚓的急性毒性14 d的LC50＞60支/kg（人工土壤干质量）。

表4 加热卷烟烟支废弃物浸出液对蚯蚓的影响（均值±标准差）Tab.4 Effects of extracts from used HTP butts on earthworms（mean±SD）

2.5 固有生物降解实验结果

加热卷烟烟支废弃物的浸出液在活性污泥中的微生物作用下，在第1~12 d内生物需氧量快速上升，后续实验周期内生物需氧量也稳步上升，这说明加热卷烟烟支废弃物浸出液发生了生物降解，并且在实验早期降解较为迅速。统计计算后的实验结果表明，加热卷烟烟支废弃物浸出液的28 d累计生物降解率为81.09%，参照物苯胺28 d的累计生物降解率为80.85%（图1）。苯胺0~4 d的固有生物降解曲线显示生物降解率为负值，推测原因为苯胺的降解初期阶段，其中间产物可能对活性污泥中的微生物略有抑制效应，其耗氧量略低于空白值，所以结果呈现负值；后期随苯胺降解速率的提高，进入降解期，该抑制作用产生的影响可以忽略。

图1 加热卷烟烟支废弃物浸出液处理组和对照组的固有生物降解曲线Fig.1 Inherent biodegradation curves for extracts from used HTP butts and the control

2.6 鱼类富集实验结果

生物富集性是根据暴露水体和斑马鱼体内的加热卷烟烟支废弃物浸出液中关注成分——烟碱浓度进行测算。本研究中采用稳态时斑马鱼体中实验样品浓度和暴露水体中实验样品浓度的比值，计算生物富集系数BCF（Bio-concentration factors），然后取每个浓度组中两个平行组的均值，得到0.05和0.50支/L的加热卷烟烟支废弃物浸出物中烟碱对斑马鱼的生物富集性结果分别为4.74和4.94（图2和图3）。从富集动态曲线看，斑马鱼体内烟碱浓度与暴露水体中的烟碱浓度在第3天基本达到动态平衡，后续暴露期间斑马鱼体内的烟碱浓度无明显增加。

图2 0.05支/L浓度组中烟碱的BCF-时间曲线Fig.2 BCF-time curves of nicotine at a concentration of 0.05 cig/L

图3 0.50支/L浓度组中烟碱的BCF-时间曲线Fig.3 BCF-time curves of nicotine at a concentration of 0.50 cig/L

3 讨论

近年来新型烟草制品中的加热卷烟烟支废弃物，也逐渐进入生态毒性研究的领域。Baran等［8］对加热卷烟烟支废弃物浸出液的生态毒性实验研究结果表明，加热卷烟烟支废弃物的浸出液具有一定的微生物抑制毒性，影响微生物分解污染物的能力。本研究中也发现加热卷烟烟支废弃物对环境中的羊角月牙藻有一定的生长抑制作用，这可能与加热卷烟使用过后，烟支废弃物中残留了部分烟碱有关。

本研究中选取的三级水生生物物种（羊角月牙藻、大型溞和斑马鱼）中，大型溞是水生生态毒性中对加热卷烟浸出液的毒性较为敏感的物种，其EC50最小，为0.665支/L。加热卷烟烟支废弃物浸出液的斑马鱼急性毒性96 h的LC50值为2.236支/L，表现出一定的水生鱼类毒性。加热卷烟烟支废弃物的浸出液具有一定的水生毒性，但不同水生生物的毒性大小存在差异。

陆生生物毒性实验中，在加热卷烟的蚯蚓急性毒性实验中发现，在高达60支/kg（人工土壤干质量）浸出液的浓度下，暴露长达14 d，也未发现任何蚯蚓出现死亡或者中毒症状，这说明加热卷烟烟支废弃物的陆生生物毒性可能较小。

对加热卷烟烟支废弃物浸出液的生物降解性进行研究发现，在本实验条件下，加热卷烟烟支废弃物的浸出液具有良好的固有生物降解性，其在实验的28 d内有80%以上发生了生物降解。加热卷烟烟支废弃物浸出液的环境风险性与其在环境中存在的时间相关，环境中存在时间越短（浸出液发生生物降解，转为无机物），其对环境的潜在风险相对越低。

关于加热卷烟烟支废弃物中烟碱的生物富集性文献报道不多，一般用生物富集因子（BCF，Bio-concentration factor）表示烟碱在鱼体内的富集程度。Hansch等［9］根据烟碱的正辛醇-水分配系数（lgKow=1.17）预估的鱼体中烟碱的BCF为3。这与本实验中的BCF值（4.74）接近。

从上述实验结果可以得出，加热卷烟烟支废弃物的浸出液具有一定的水生生物毒性，但陆生生物毒性相对较小。加热卷烟烟支废弃物浸出液具有良好的生物降解性，且浸出液中的关注成分烟碱属于低富集性物质［10］，通过合理控制加热卷烟烟支废弃物进入水体环境，可降低加热卷烟烟支废弃物的环境风险。进一步研究加热卷烟烟支废弃物的环境暴露量，以及其他生物物种的急性毒性作用或慢性毒性作用，将可进一步明确和评估加热卷烟烟支废弃物的环境风险［11-12］。

4 结论

本实验条件下，加热卷烟烟支废弃物的浸出液具有一定的水生生物急性毒性，但无明显的陆生生物急性毒性，加热卷烟烟支废弃物浸出液具有固有生物降解性，且加热卷烟烟支废弃物浸出液中的关注成分——烟碱富集性低，因此加热卷烟烟支废弃物浸出液的环境风险相对较小。