烘烤前后烟叶葡萄糖和氨基酸及Amadori化合物含量的差异分析

张 婕，赵会纳，，朱文静，武圣江，杨 慧，苏贤坤，张孝廉，许冬青，雷 波*，

1.贵州省烟草科学研究院烟草行业山地烤烟品质与生态重点实验室，贵阳市龙滩坝路29号550081

2.贵州省烟草科学研究院烟草行业分子遗传重点实验室，贵阳市龙滩坝路29号550081

3.贵州省烟草质量监督检测站，贵阳市龙滩坝路29号550081

美拉德反应是烟叶烘烤过程中香味物质形成的主要途径之一［1-2］。Amadori化合物是美拉德反应中醛糖和不同氨基酸通过缩合、脱水、重排得到的第一类稳定产物［3-6］，在香气、风味和颜色的形成过程中起着核心作用［5,7-13］。不同氨基酸与葡萄糖反应形成的Amadori化合物结构不同，产生的香气物质种类和含量也存在差异，因此Amadori化合物的种类和含量与烟叶香型和品质关系密切［14-15］。有研究表明，番茄、甜椒和洋葱等蔬菜中的Amadori化合物的形成受生长、采收、热加工过程等多种因素的影响，与其反应底物（游离氨基酸种类、浓度、还原糖浓度）也密切相关［3,4,10-11］。因此，研究烘烤过程中糖和游离氨基酸含量变化及其通过美拉德反应途径的转化规律对改善烟叶品质具有积极作用。

有研究表明，烤后烟叶中的葡萄糖和果糖（还原糖）在一定范围内与烟叶感官品质总体上呈正相关［16-17］。赵会纳等［16］、杨立均等［18］对不同生态区、不同品种烟叶烘烤前后糖含量变化进行了研究，发现还原糖在烤后烟叶中均大幅增加，而游离氨基酸种类较多；徐磊等［17］、过伟民等［19］研究表明，烟叶中游离氨基酸含量和组成在年份和产区间差异较大，多数游离氨基酸与烟叶品质存在负相关关系，但在不同生态区间与品质负相关的氨基酸种类不同。目前关于烘烤过程中游离氨基酸的研究主要集中于不同烘烤措施对烟叶中大分子蛋白质向游离氨基酸转化降解的变化规律方面［19-21］。过伟民等［19］研究发现，在烘烤过程中多数游离氨基酸含量表现为先上升后下降的趋势，与品质稳定负相关的氨基酸多为美拉德反应活性较强的氨基酸，其在烘烤中后期下降幅度也较大；王爱华等［20］、陈颐等［21］的研究结果均表明，适当延长变黄期有利于促进蛋白质降解和游离氨基酸的生成，为烘烤后期生成香气物质提供了更多的反应底物；陈颐等［22］试验认为转氨酶活性高可促进游离氨基酸之间的转化从而促进烤后烟叶品质的提高。

美拉德反应作为烘烤过程产香的主要途径，从氨基酸参与美拉德反应活性的角度分析烘烤过程中烟叶游离氨基酸含量变化差异原因的报道较少［2,19］，而将Amadori化合物作为美拉德反应关键物质，研究其反应底物糖和游离氨基酸在烘烤过程中变化及参与美拉德反应的转化规律尚鲜见报道。为此，采用半叶法研究了K326和毕纳1号中部烟叶葡萄糖、游离氨基酸和Amadori化合物含量在烘烤前后的变化规律，比较了烘烤前后6种Amadori化合物及其相关氨基酸的转化率在品种间的差异，旨在解析烟叶葡萄糖、游离氨基酸通过美拉德途径的转化规律，改善烟叶品质。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验在贵州省烟草科学研究院福泉基地进行。品种为K326和毕纳1号，于5月4日移栽，行距110 cm，株距55 cm，种植密度16 500株/hm2，施氮量97.5 kg/hm2，按当地优质烟叶生产规范进行栽培管理。在烟株打顶后选取长势一致且有代表性的烟株进行挂牌，在烟株第11叶位（从下向上数）成熟时采用半叶法单叶取样，所采集的新鲜烟叶一半经液氮保存后真空冷冻干燥，另一半带主脉烘烤。采用密集烘烤，烤房装烟密度为75 kg/m3，将K326和毕纳1号挂牌的烟叶样品放在烤房第2层（从顶层算起）烘烤，每个生物学重复取8片叶，共6次重复。

1.2 测定方法

参照文献［23］的方法，采用中试型冻干机（PiloFD系列，美国西蒙国际公司）对液氮保存的新鲜烟叶进行真空冷冻干燥；采用FED240型电热恒温箱（德国Binder公司）将烤后样品于40℃烘干至恒质量。

采用LC-MS/MS法［24］同时测定烟草样品中的游离氨基酸与Amadori化合物含量（质量分数）。样品前处理：准确称取烟叶样品0.1 g于50 mL离心管中，加入0.1 mL浓度分别为39和16 mmol/mL的2-氨基丁酸（2-ABA）、缬氨酸-d8（Val-d8）内标储备液、20 mL超纯水，超声萃取10 min，取萃取液2 mL，8 000 r/min离心15 min，过0.22 μm微孔滤膜。

色谱条件：色谱柱为戴安Acclaim Explosive E2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A），0.1%（体积分数）甲酸水溶液（B）；流速为400 μL/min；柱温为30℃；进样量为2 μL；梯度洗脱：0~4.7 min，4%~35%A；4.7~8.7 min，35%~77%A；8.7~13.0 min，77%~100%A；13.1~19.0 min，1%~1%A。

质谱条件：离子源为ESI源；检测方式：正离子检测；扫描方式：MRM；喷雾电压：3 200 V；鞘气流速4.2 L/min；辅助气流速6.4 L/min；毛细管温度275℃；气化温度150℃；碰撞室压力0.133 Pa。

按照文献［25］介绍的方法测定烟叶葡萄糖含量（质量分数）。

1.3 美拉德反应程度评价

选择6种具有较高美拉德反应活性［4,7,11］且在烤后烟叶中含量差异较大的氨基酸［18-19,24］及其对应的Amadori化合物用于美拉德反应评价。以果糖-氨基酸（如：果糖-丙氨酸）的形式表示各不同游离Amadori化合物。参照Troise A D等［11］的方法，烟草样品中游离氨基酸在美拉德反应中的转化率以某果糖-氨基酸含量占其与对应游离氨基酸含量总和的百分比来评价。

1.4 数据处理

采用SPSS 18.0软件进行独立样本t检验和简单相关分析。

2 结果与分析

2.1 烘烤前后烟叶葡萄糖、游离氨基酸和6种Amadori化合物含量差异

2.1.1 烘烤前后烟叶葡萄糖含量差异

由表1可以看出，烘烤后毕纳1号和K326烟叶中葡萄糖含量均极显著增加，但烘烤前后葡萄糖含量在两品种间差异不显著。

表1 烘烤前后两品种间烟叶葡萄糖含量的差异①Tab.1 Variance analysis on glucose contents in tobacco leaves before and after flue-curing between the two cultivars

2.1.2 烘烤前后烟叶游离氨基酸含量的差异

烘烤前后两品种烟叶中16种游离氨基酸含量变化趋势相似（表2）。其中烘烤后7种游离氨基酸（赖氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、缬氨酸、色氨酸）含量和游离氨基酸总量均极显著增加，3种游离氨基酸（天冬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸）含量均极显著下降，1种游离氨基酸（精氨酸）含量显著下降，3种游离氨基酸（丝氨酸、谷氨酸、酪氨酸）含量与烤前烟叶差异不显著。此外，烘烤后K326烟叶中的苯丙氨酸含量极显著增加，毕纳1号烟叶中的苏氨酸含量显著降低。

表2 烘烤前后两品种烟叶游离氨基酸含量的差异Tab.2 Variance analysis on free amino acid contents in tobacco leaves before and after flue-curing between the two cultivars

烘烤前后两品种间游离氨基酸含量也存在一定差异，其中烘烤前K326烟叶中赖氨酸、谷氨酰胺和色氨酸含量极显著高于毕纳1号，脯氨酸和游离氨基酸总量显著高于毕纳1号，丝氨酸和苯丙氨酸显著低于毕纳1号；烘烤后K326烟叶的谷氨酸含量极显著高于毕纳1号，赖氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸和天冬酰胺及游离氨基酸总量显著高于毕纳1号。

2.1.3 烘烤前后烟叶中6种Amadori化合物含量的差异

由表3可以看出，毕纳1号和K326烟叶中6种Amadori化合物均在烘烤过程中产生，在烘烤前的烟叶中均未检测到，其含量高低与烤后烟叶中游离氨基酸含量高低顺序总体一致，均以果糖-丙氨酸含量最高，果糖-亮氨酸含量最低，果糖-缬氨酸含量次低。但两个品种间的Amadori化合物含量存在差异，其中K326烟叶中果糖-丙氨酸和果糖-缬氨酸含量极显著低于毕纳1号，果糖-亮氨酸和果糖-色氨酸显著低于毕纳1号。

表3 烘烤前后两品种烟叶Amadori化合物的差异Tab.3 Variance analysis on Amadori compounds in tobacco leaves before and after flue-curing between the two cultivars

2.2 葡萄糖、游离氨基酸与Amadori化合物的相关性

由表4可以看出，葡萄糖和5种游离氨基酸（丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和色氨酸）与其对应的Amadori化合物均存在极显著的正相关，亮氨酸与其对应的美拉德反应呈极显著的负相关。

2.3 不同游离氨基酸参与美拉德反应的转化率及在品种间的差异

由表5可以看出，毕纳1号和K326烟叶中的6种游离氨基酸参与美拉德反应的转化规律相似，均以丙氨酸的转化率最高（79.30%和69.35%），缬氨酸转化率次之（68.73%和56.82%），脯氨酸转化率最低（20.23%和14.82%），亮氨酸转化率次低（39.50%和24.32%）。但游离氨基酸在品种间的转化率不同，其中5种游离氨基酸的转化率在品种间的差异均达到了显著水平，毕纳1号烟叶的脯氨酸、亮氨酸和色氨酸的转化率极显著高于K326，丙氨酸和缬氨酸显著高于K326。

表5 6种游离氨基酸参与美拉德反应的转化率及两品种间的差异分析Tab.5 Variance analysis on conversion rates of six free amino acids involved in the Maillard reaction and differences between the two cultivars

3 讨论

本试验中发现，烘烤后K326和毕纳1号烟叶葡萄糖和游离氨基酸总量均极显著增加，其中游离氨基酸总量的增加主要受烤后烟叶中脯氨酸含量大量增加的影响，各游离氨基酸之间含量差异较大且变化趋势不同，这与前人研究结果一致［19］。本试验中考察的6种游离氨基酸均在烘烤过程中参与了美拉德反应，6种Amadori化合物均在烘烤过程中产生，其含量变化与烤后烟叶中游离氨基酸含量变化总体趋势一致，说明烘烤过程中淀粉降解生成的葡萄糖含量充足，底物氨基酸含量的差异是影响Amadori化合物含量差异的主要因素。对于葡萄糖、游离氨基酸与Amadori化合物的相关分析也表明，葡萄糖含量与6种Amadori化合物含量均呈正相关，游离氨基酸含量差异是导致Amadori化合物含量差异的主要原因。

不同游离氨基酸参与美拉德反应的转化率差异明显。丙氨酸与缬氨酸的转化率较高、脯氨酸最低，这与前人报道的丙氨酸与缬氨酸参与美拉德反应活性较高、脯氨酸活性较低的结果相符［4,7,19］。本试验中还发现，虽然在烟叶烘烤过程中脯氨酸和丙氨酸大量生成，且脯氨酸含量远高于其他氨基酸，但由于其转化率最低，导致其生成的Amadori化合物含量略低于丙氨酸。可见，游离氨基酸参与美拉德反应后的转化率受到其自身含量及美拉德反应活性的双重影响［1,4］，这可能也是导致脯氨酸含量与烟叶品质相关性不显著的原因之一［4,7］。

两品种中的葡萄糖与丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸的含量在烘烤前后无显著差异，但这3种游离氨基酸参与美拉德反应的转化率及生成的Amadori化合物含量均为毕纳1号显著高于K326。在烟叶烘烤过程中，美拉德反应不仅受到氨基化合物和羰基化合物含量和类型的影响［1,4］，环境温度、加热时间、细胞内pH及含水率等也是重要的影响因素［2,3,5,26］。因此，在烘烤条件一致的情况下，这些物质含量及转化率的差异可能是由于不同品种间的遗传特性（细胞内pH及含水率）的差异所致［5,11］，但仍有待进一步研究。

4 结论

烘烤后烟叶葡萄糖和游离氨基酸总量均极显著增加，其中游离氨基酸总量的增加主要来自于脯氨酸的贡献。6种Amadori化合物均在烘烤过程中产生，不同氨基酸生成Amadori化合物的转化率不同，其中丙氨酸的转化率最高，缬氨酸次之，脯氨酸最低；毕纳1号5种游离氨基酸的转化率均显著高于K326。烤后烟叶中生成Amadori化合物含量的高低受到反应底物氨基酸的含量及其美拉德反应活性的双重影响。品种间遗传特性差异也对烤后烟叶美拉德反应底物转化和Amadori化合物含量产生显著影响。