不同介质中烟碱的感官作用特征及其影响因素

范 武，叶远青，谢寄清，郭晓东，姬凌波，柴国璧，刘俊辉，霍现宽，毛 健，席 辉，王丁众，史清照，宋瑜冰，马 骥，宗永立，张建勋，张天兵*，张启东*

1.中国烟草总公司郑州烟草研究院 烟草行业烟草香料基础研究重点实验室，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号450001

2.江苏中烟工业有限责任公司技术中心，南京市兴隆大街29号210019

在嗜好性消费品复杂的风味体系中，往往存在一种“核心风味成分”，例如烟草制品中的烟碱、酒类产品中的乙醇、碳酸饮料中的CO2。核心风味成分的存在是这些嗜好性消费品保持产品类型的必要条件，核心风味成分的质量分数水平和递送方式是产品品类划分的标志性特征。核心风味成分的感官效应对产品风味设计和工艺调控具有重要影响，明确其感官作用特征及影响因素则是产品开发必须面对的重要命题。目前对烟碱感官特征的报道存在一定差异。韩富根［1］指出烟碱具有强烈的辛辣感；Thuerauf等［2］报道了烟碱作用于鼻腔会产生强烈的嗅觉刺激性；赖燕华等［3］以感官导向方式从初烤烟叶中分离出一种口腔辣感组分，并明确了烟碱是该组分的关键性辣感成分；冒德寿等［4］则认为烟碱同时具有辣感和苦味，而在卷烟主流烟气中通常表现为苦味；一些网络百科全书（如维基百科、百度百科等）中，多将烟碱的感官作用描述为苦味或焦苦味。事实上，已发现烟碱能够激活一种三叉神经系统末梢的瞬时受体电位通道（Transient receptor potential channel，也称TRP受体）亚型TRPA1［5］。TRP受体除了能被特定化合物激活以外，也对高温（43℃以上）和局部组织损伤产生响应［6］，与刺激性感受具有密切联系。化合物激活TRP受体产生的感官效应被称为“Chemesthesis”［7］，目前常将其译为“化学感觉”［8］或“化学物理觉”［9］，这是烟碱感官作用重要的生理基础。

当前烟草制品多元化发展趋势日益显著，而在各类型烟草制品的使用过程中，烟碱处于不同的介质环境。传统卷烟主流烟气粒相物以油溶性成分为主，水溶性部分的质量仅占约三分之一［10］，因此传统卷烟烟气中烟碱处于相对亲油性的气溶胶环境。加热卷烟消费时产生大量水分［11］，电子烟则直接以甘油和丙二醇等亲水成分作为发烟溶剂，造成其烟气中烟碱处于相对亲水性的气溶胶环境；而使用口含烟时，溶出的烟碱实际处于水溶液环境。针对不同介质环境中烟碱的感官作用特征、风味阈值及其影响因素的系统性分析比对研究鲜见报道。为此，系统评价了不同质量分数的烟碱在水溶液、亲水性气溶胶（丙二醇）和亲油性气溶胶（三乙酸甘油酯）等介质模型中的感官作用特征，测定了各介质中烟碱的风味觉察阈值，分别利用pH值和核磁共振（NMR）技术计算了不同质量分数烟碱水溶液和烟碱气溶胶冷凝物中的游离烟碱比例（αfbn）；分别考察了各介质中乳酸和薄荷醇对烟碱感官作用特征、风味觉察阈值以及αfbn的影响；对比了相同质量分数的烟碱在丙二醇和三乙酸甘油酯气溶胶介质中感官作用的差异，并利用顶空固相微萃取-气质联用技术（SPME-GC/MS）研究了这2种介质极性对烟碱气相分布的影响，旨在为中式卷烟满足感、舒适性提升及新型烟草制品的研发提供基础支撑。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

1,2-丙二醇（99.8%，北京百灵威科技有限公司）；三乙酸甘油酯［99.9%，阿法埃沙（中国）有限公司］；烟碱（＞98%，陕西天则生物技术有限责任公司）；乳酸（98%）、薄荷醇（99%）（美 国Sigma-Aldrich公司）；蒸馏水（屈臣氏饮用水，广州屈臣氏食品饮料有限责任公司）；2-甲基喹啉（内标，99%）、（E）-3-己烯酸（内标，98%）（美国Across公司）；N，O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺［N，O-Bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide，BSTFA，＞99%，美国Regis Technologies公司］；二甲基亚砜-d6（DMSO-d6，99.8% D，0.03% TMS）、叔丁胺（99%）、乙酸（98%）（美国Alfa Aesar公司）。

SM450型20孔道 吸烟 机（英国Cerulean公司）；7895A/5975C气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司）；AVANCE NEO 600M核磁共振仪（德国Bruker公司）；电子烟TF33-T29型一次性可更换烟弹、电子烟TF3301A型电池（深圳麦克韦尔科技有限公司）；同轴核磁管（美国Norell公司）；PHS-3C酸度计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；44 mm剑桥滤片（英国Whatman公司）；CP224S型分析天平（感量0.000 1 g，德国Sartorius公司）；50/30 μ m DVB/CAR/PDMS固相微萃取（SPME）萃取纤维头（美国Supelco公司）；SPME自动进样平台、20 mL带橡胶垫螺纹顶空进样玻璃瓶（德国Gerstel公司）；0.45 μm尼龙滤膜（天津津腾公司）。

1.2 方法

1.2.1 气溶胶中烟碱、薄荷醇和乳酸释放量的测定

对水溶液体系而言，所评价溶液中烟碱和其他成分的质量分数能够在溶液配制阶段准确控制。但对气溶胶体系而言，需要利用电子烟具将各类介质的烟碱溶液生成气溶胶进行评价，因此需要首先明确“溶液烟碱质量分数-气溶胶烟碱释放量”的关系，以便获取所评价气溶胶中烟碱的准确释放量。利用6个不同介质（表1）制备了不同质量分数的烟碱溶液（20.0、10.0、5.00、2.50、1.25、0.625、0.313和0.157 mg/g），并利用电子烟具生成气溶胶。由于气溶胶中绝大部分烟碱分布于粒相［12］，因此收集粒相物并进行烟碱定量分析。同时，为了明确部分类型介质气溶胶中薄荷醇和乳酸的准确释放量，也对其粒相物进行定量分析。

表1 用于产生气溶胶的6种介质Tab.1 Six media for aerosol generation

（1）气溶胶粒相物制备与收集。将0.700 g不同介质烟碱溶液加入一次性可更换烟弹中，将电池充满电，按CORESTA推荐方法《CRM No.81—Routine analytical machine for e-cigarette aerosol generation and collection—Definitions and standard conditions》中的规定进行电子烟抽吸和粒相物捕集：每30 s抽吸1口，每口抽吸时间持续3 s，抽吸容量为55 mL，抽吸曲线为矩形，采用剑桥滤片捕集气溶胶粒相物，每张滤片捕集10口的气溶胶。

（2）烟碱和薄荷醇的定量分析。取一片完成气溶胶粒相物捕集的剑桥滤片置于50 mL具塞锥形瓶中，加入20 mL含内标的异丙醇萃取剂（内标物为2-甲基喹啉），室温振荡40 min，静置5 min，用尼龙滤膜过滤上清液。取1.5 mL滤液至色谱瓶中，进行GC-MS分析，每个样品测定3次，取平均值。GC/MS参数：

色谱柱：DB-WAXETR毛细管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气：He；柱流量：1 mL/min；进样口 温 度：230℃；程 序 升 温：110℃（1 min）；分流比：60∶1；进样量：1 μL；传输线温度：230℃；电离模式：EI；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；电离能量：70 eV；溶剂延迟：8 min；扫描模式：选择离子扫描，根据保留时间划分时间段。待测化合物的保留时间、定性及定量离子的参数选择见表2。

表2 烟碱、薄荷醇及内标的保留时间和选择离子Tab.2 Retention time，quantitative and qualitative ions of nicotine，menthol and the internal standard

（3）乳酸的定量分析。取一片完成气溶胶粒相物捕集的剑桥滤片置于50 mL具塞锥形瓶中，加入20 mL丙酮及（E）-3-己烯酸内标，室温振荡30 min，用尼龙滤膜过滤上清液。取1 mL滤液至色谱瓶中，加入100 μL衍生化试剂BSTFA，置于60℃水浴中反应80 min，冷却至室温后进行GC-MS分析，每个样品测定3次，取平均值。GC/MS参数：

色谱柱：DB-5MS毛细管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气：He；柱流量：1 mL/min；进样口温度：250℃；程序升温：50℃（1 min）5℃/min 180℃（0 min）；分流模式：不分流；进样量：1 μL；传输线温度：230℃；电离模式：EI；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；电离能量：70 eV；溶剂延迟：12 min；扫描模式：选择离子扫描，根据保留时间划分时间段。待测化合物保留时间、定性及定量离子的参数选择见表3。

1.2.2 不同介质中烟碱的感官特征评价和觉察阈值测定

1.2.2.1 水溶液介质

分别利用蒸馏水、5 mg/g乳酸水溶液和1 mg/g薄荷醇水溶液3种介质配制初始质量分数为1 mg/g的烟碱溶液。利用对应介质，将各初始溶液按质量逐级等比例稀释得到一系列不同质量分数的烟碱溶液，用于烟碱感官特征评价和觉察阈值测定。

室温（25℃）下，7名具有卷烟感官评吸资质的评价员分别使用移液枪移取40 μL各质量分数烟碱溶液置于舌面，闭口正常呼吸，保持30 s，随后用蒸馏水漱口清除残留溶液。采用5分制标度打分法对不同质量分数烟碱溶液的苦味特征、口腔刺激和鼻腔刺激的强度进行评价，其中，1分为弱，2分为较弱，3分为适中，4分为较强，5分为强烈。

分别将各质量分数烟碱溶液样品与2个对应介质样品作为一组，由上述7名评价员依据GB/T 22366—2008［13］中针对最优估计阈值（Best estimate threshold，BET）法测定风味物质阈值的描述，采用三点选配法（Three-alternative forced-choice method）测定烟碱在3种水溶液介质中的觉察阈值。

1.2.2.2 气溶胶介质

依据1.2.1节中所获得的“溶液烟碱质量分数-气溶胶烟碱释放量”关系，分别利用表1中6种不同介质配制其对应气溶胶烟碱释放量为10、3和1 mg/g的烟碱溶液。将电池充满电，7名具有卷烟感官评吸资质的评价员分别使用电子烟具评价各烟碱气溶胶的感官特征，采用5分制标度打分法对不同质量分数烟碱溶液的苦味特征、口腔刺激、鼻腔刺激、喉部刺激和整体刺激强度进行评价，其中，1分为弱，2分为较弱，3分为适中，4分为较强，5分为强烈。

利用表1中6种不同介质配制初始质量分数为5 mg/g的烟碱溶液。利用对应介质，将各初始溶液按质量逐级等比例稀释得到一系列不同质量分数的烟碱溶液，用于气溶胶介质中烟碱觉察阈值测定。分别将各质量分数烟碱溶液样品与2个对应介质样品作为一组，制作电子烟烟弹，依据1.2.1节中所获得的“溶液烟碱质量分数-气溶胶烟碱释放量”关系，计算每种烟弹对应气溶胶中烟碱释放量。将电池充满电，由上述7名评价员抽吸各烟弹的气溶胶，依据GB/T 22366—2008［13］中针对BET法测定风味物质阈值的描述，采用三点选配法测定烟碱在6种气溶胶介质中的觉察阈值。

针对烟碱感官评价实验的安全性说明：

欧洲食品安全局（Europe Food Safety Authority，EFSA）依据烟碱最低可见有害作用水平（Lowest observed adverse effect level，LOAEL）0.003 5 mg/kg体质量，给出烟碱日允许摄入量（Acceptable daily intake，ADI）为0.000 8 mg/kg体质量［14］。基于此，在上述烟碱感官评价实验中，所有评价人员均通过控制每日评价样品数量的方式，保持日均烟碱可能摄入量低于EFSA给出的ADI要求。

1.2.3 不同介质中游离烟碱比例（αfbn）的计算方法

蒸馏水、乳酸水溶液和薄荷醇水溶液3种水相介质中，通过测定室温（25℃）下各溶液的pH值，利用公式（1）计算αfbn［12］。

式（1）中，αfbn代表游离态烟碱比例，即游离态烟碱量占总烟碱量的比例；pH为烟碱水溶液的pH值；Ka为单质子态烟碱在水中的平衡常数（25℃时为10－8.01）。

丙二醇、乳酸丙二醇溶液、薄荷醇丙二醇溶液、三乙酸甘油酯、乳酸三乙酸甘油酯溶液、薄荷醇三乙酸甘油酯溶液等6种介质气溶胶中的αfbn可基于核磁氢谱信息计算获得［15］。

单质子态烟碱与游离态烟碱标准样品制备：配制含24 mg/g烟碱和100 mg/g乙酸的丙二醇溶液、24 mg/g烟碱和100 mg/g乙酸的三乙酸甘油酯溶液，分别作为丙二醇和三乙酸甘油酯中单质子态烟碱标准样；配制含24 mg/g烟碱和11 mg/g叔丁胺的丙二醇溶液、24 mg/g烟碱和11 mg/g叔丁胺的三乙酸甘油酯溶液，分别作为丙二醇和三乙酸甘油酯中游离态烟碱标准样。将标准样和DMSO-d6分别加入到同轴核磁管的内管与外管中，将核磁管置于核磁共振仪中测定氢谱。

待测样品中游离态烟碱比例计算：按照各气溶胶介质中烟碱和其他成分的释放量配制溶液作为待测样品，将待测样和DMSO-d6分别加入到同轴核磁管的内管与外管中，将核磁管置于核磁共振仪中测定氢谱。

依据公式（2），利用待测样品和对应介质标准样品氢谱中烟碱吡啶环上Ha与吡咯环上He化学位移的差值计算待测样品的αfbn。

式（2）中，Δδ代表氢谱中烟碱吡啶环上Ha与吡咯环上He的化学位移的差值。

1.2.4 烟碱丙二醇溶液和烟碱三乙酸甘油酯溶液的SPME-GC/MS分析

配制2 mg/g的烟碱丙二醇溶液和烟碱三乙酸甘油酯溶液。分别称取10 mg溶液置于顶空瓶中，密封。利用SPME自动进样平台，将两类样品在40℃分别平衡20、40、60、90、120、150、180、240 min后，用萃取纤维头顶空吸附10 min，在进样口250℃下解吸附3 min，进行GC/MS分析。以所得烟碱峰面积表征两种相同质量分数烟碱溶液气相分布的差异。GC/MS分析参数：

色谱柱：DB-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气：He；柱流量：1.5 mL/min；进样口温度：250℃；程序升温：50℃（0 min）5℃/min 280℃（10 min）；分流模式：不分流；传输线温度：250℃；电离模式：EI；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；电离能量：70 eV；扫描模式：全扫描；扫描范围：33~500 amu。

2 结果与讨论

2.1 气溶胶介质中烟碱、薄荷醇和乳酸的释放量

通过测定6种不同介质（表1）中8个质量分数下（20.0、10.0、5.00、2.50、1.25、0.625、0.313和0.157 mg/g）烟碱溶液由电子烟具所生成气溶胶中的烟碱释放量，获得了感官评价实验范围内“溶液烟碱质量分数-气溶胶烟碱释放量”的函数关系，如图1所示。可以看出，不同介质溶液中烟碱质量分数与对应气溶胶的烟碱释放量均呈现良好的线性关系，为明确后续所评价各类气溶胶中烟碱的准确释放量提供了便利。

图1 6种不同介质溶液中烟碱质量分数和对应气溶胶中烟碱释放量的线性关系Fig.1 Linear relationships between nicotine contents in solutions prepared with six different media and releases of nicotine in corresponding aerosols

同时，含有乳酸和薄荷醇的介质所生成气溶胶中乳酸和薄荷醇的释放量稳定，分别为1.60 mg/g乳酸（5 mg/g乳酸丙二醇溶液）、1.50 mg/g乳酸（5 mg/g乳酸三乙酸甘油酯溶液）、0.38 mg/g薄荷醇（1 mg/g薄荷醇丙二醇溶液）和0.52 mg/g薄荷醇（1 mg/g薄荷醇三乙酸甘油酯溶液）。

2.2 不同介质中烟碱的感官作用特征和αfbn

3种水相介质中不同质量分数烟碱的感官作用特征、觉察阈值和αfbn如表4所示。评价过程中，所有评价员均未感受到明显的苦味和鼻腔刺激，烟碱纯水溶液主要带来口腔刺激，随烟碱质量分数降低，溶液刺激性下降且αfbn随之下降；5 mg/g乳酸溶液中不同质量分数烟碱的αfbn均小于10-6数量级，这意味着该介质中绝大部分烟碱以质子化状态存在，导致溶液刺激性显著下降，但仍具有可感知的刺激性；薄荷醇在不改变αfbn的前提下也能显著降低溶液的口腔刺激，但同时带来清凉感；乳酸和薄荷醇的存在均显著提高了烟碱在水相介质中的觉察阈值。

表4 3种水相介质中烟碱的感官作用特征、觉察阈值和αfbn①Tab.4 Sensory characteristics，detection thresholds and αfbn of nicotine in three aqueous media

基于2.1节所获得烟碱等成分溶液质量分数与气溶胶释放量的关系，对6种气溶胶介质中烟碱的感官特征进行评价，并测定觉察阈值和αfbn，各介质气溶胶中烟碱觉察阈值和烟碱释放量为10 mg/g的感官评价结果见表5。评价过程中，所有评价员均未感受到明显的苦味和口腔刺激，各烟碱气溶胶主要带来鼻腔刺激、喉部刺激和劲头。

乳酸的存在造成气溶胶中烟碱αfbn有所下降，且亲水性介质中αfbn下降更加明显。例如，在乳酸-丙二醇介质中，烟碱的1H NMR化学位移整体移向低场，其中四氢吡咯环的氮甲基上3个氢（He）的化学位移变化尤其明显（图2）；薄荷醇在不改变αfbn的前提下也能显著降低气溶胶的鼻腔刺激和喉部刺激，但基本不改变劲头，同时带来清凉感；乳酸和薄荷醇的存在均提高了烟碱在气溶胶介质中的觉察阈值，且乳酸对烟碱觉察阈值的影响更为显著。

图2 丙二醇中游离态烟碱标准样（a）、丙二醇中烟碱-乳酸样品（b）和丙二醇中单质子态烟碱标准样（c）的1H NMR谱Fig.2 1H NMR spectra of free nicotine standard sample（a），nicotine-lactic acid sample（b）and single proton nicotine standard sample（c）in propylene glycol

通过上述评价结果可以看出，烟碱在水溶液和气溶胶中的感官作用部位存在显著差异。烟碱水溶液主要产生口腔刺激，考虑到评价员并未吞咽溶液，因此不排除其产生喉部刺激的可能，但评价时闭口正常呼吸并未感受到鼻腔刺激；相反，烟碱气溶胶则主要带来鼻腔刺激和喉部刺激，即使在烟碱气溶胶质量分数较高时（10 mg/g）评价员也未感受到明显的口腔刺激。同时，烟碱在水中的觉察阈值明显低于其在丙二醇和三乙酸甘油酯气溶胶中的觉察阈值。

乳酸和薄荷醇分别通过降低游离烟碱比例和产生反向化学感觉两种途径影响烟碱感官作用。烟碱只有在游离状态才能进入气相，有研究者认为气相游离烟碱是烟草制品产生刺激性和劲头的主要原因［12］，有机酸通过降低体系αfbn减少了游离烟碱的气相分布，从而减弱体系的刺激性；然而，水溶液中烟碱产生显著的口腔刺激，该效应同样随αfbn降低而减小，证明游离烟碱的刺激性表现并不依赖其气相分布。另一方面，从感官作用的分子机制看，烟碱通过激活热效应化学感觉受体TRPA1产生刺激性［5］；而薄荷醇一方面能够激活冷效应化学感觉受体TRPM8［16］造成与烟碱相反的化学感觉效应，另一方面能够抑制TRPA1［17］从而有可能降低烟碱带来的刺激性。

2.3 气溶胶介质极性对烟碱感官作用和顶空分布的影响

相同烟碱释放量的丙二醇气溶胶和三乙酸甘油酯气溶胶感官特征的差异见表6。可以看出，烟碱三乙酸甘油酯气溶胶的鼻腔刺激和喉部刺激普遍高于相同质量分数的烟碱丙二醇气溶胶。由表5可知，三乙酸甘油酯气溶胶中烟碱的觉察阈值也明显低于丙二醇气溶胶。由于在丙二醇气溶胶和三乙酸甘油酯气溶胶两个体系中，烟碱均以游离状态存在，同时游离烟碱的气相分布也是影响烟碱感官作用的原因之一［12］，因此考察了相同质量分数的烟碱丙二醇和烟碱三乙酸甘油酯两种溶液的烟碱顶空分布情况。

表6 丙二醇和三乙酸甘油酯气溶胶中烟碱的感官作用特征Tab.6 Sensory characteristics of nicotine in propylene glycol and glyceryl triacetate aerosols （分）

由图3可知，相同质量分数下烟碱三乙酸甘油酯溶液的烟碱顶空分布明显高于烟碱丙二醇溶液，表明介质极性能够显著影响游离烟碱的气相分布，是影响烟碱气溶胶感官作用的另一个重要因素。

图3 相同质量分数的烟碱丙二醇溶液和烟碱三乙酸甘油酯溶液顶空分布情况Fig.3 Headspace distribution of nicotine-propylene glycol solution and nicotine-glyceryl triacetate solution at same nicotine contents

3 结论

①烟碱水溶液主要表现为口腔刺激，烟碱气溶胶则带来鼻腔和喉部的刺激性；②烟碱在水溶液、丙二醇气溶胶和三乙酸甘油酯气溶胶中的风味觉察阈值分别为0.072、0.296和0.197 mg/g；③乳酸通过显著降低αfbn而降低烟碱刺激性并提升其觉察阈值，薄荷醇也可产生类似作用但对αfbn没有影响，不同极性的气溶胶介质则可能通过改变烟碱气相分布情况影响其感官作用特征和风味觉察阈值。