白杨素对舌鳞状细胞癌CAL-27细胞活力、形态及凋亡的影响

林晨阳，许志亮，曾宾华，罗艳荣

(中国人民解放军联勤保障部队第九○九医院耳鼻喉颌面外科，福建 漳州 363000)

舌鳞状细胞癌是一种恶性肿瘤，常发病于口腔面部，其病因目前尚不清楚。长时间吸烟喝酒、日常不注意口腔卫生、长期异物饮食是需要注意的致病因素。鳞状细胞癌具有生长速度快、转移频率高、容易浸润等特征，是导致患者病情加重甚至死亡的重要原因[1-2]。因此，研究有效抗鳞状细胞癌生长、转移的药物具有重要意义。白杨素是从传统天然药物蜂胶以及中草药中提取的具有抗炎、抗氧化、抗恶性肿瘤等药理学作用的黄酮类化合物[3-4]。体内外研究证实，白杨素及其衍生物具有抑制癌细胞活力、诱导癌细胞凋亡的作用[5-6]。有研究发现，白杨素具有抑制舌鳞状细胞活力以及促进细胞凋亡的作用[7]。因此，本研究从细胞水平角度进行分析，观察白杨素对舌鳞状细胞癌CAL-27细胞活力、形态及凋亡的影响，以期为舌鳞状细胞癌的诊治提供分子基础方面的参考。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

人口腔舌鳞状细胞CAL-27细胞系购自上海富盛实业有限公司；RPMI 1640培养基购自友康恒业生物科技(北京)有限公司；白杨素、噻唑蓝溴化四唑(MTT)以及活性Caspase-3抗体购于美国Sigma-Aldrich公司；TUNEL试剂盒、免疫染色固定液(P0098)、PBS磷酸盐缓冲液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；Bcl-2抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 MTT法检测细胞活力

将对数生长期的CAL-27细胞接种于96孔板，加入不同浓度的白杨素(1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μmol/L)，并设置不做任何处理的空白对照组及以0.1%DMSO试剂处理的DMSO组，每组设立5个复孔。24 h后，向每孔加入MTT溶液(5 mg/mL，以PBS配制)10 μL继续孵育4 h，培养结束后，将培养上清液小心吸出并丢弃，将0.1% DMSO试剂加入到每孔中,每孔100 μL，振荡10～15 min，直到结晶物充分溶解后，开始测定各孔光密度值(OD值)。细胞生存率=(白杨素各组OD值均数-空白对照组OD值均数)/(DMSO组OD值均数-空白对照组OD值均数)×100%。

1.3 细胞培养及形态观察

将舌鳞状细胞癌CAL-27细胞系放置于RPMI 1640培养基中，将细胞浓度调整为1×106/mL，置于无菌恒温(37 ℃)培养箱中进行培育。将舌鳞状细胞癌CAL-27分为空白对照组和白杨素组。空白对照组采用正常培养液培养，不加任何药物试剂；在MTT实验中，白杨素的IC50值为10.27 μmol/L，因此，白杨素组细胞用10.0 μmol/L白杨素连续处理5 d，记作白杨素组。将空白对照组与白杨素组细胞放置于细胞培养箱中培养30 min，然后使用倒置光学显微镜观察并记录。

1.4 TUNEL法检测细胞凋亡

将实验培养所用的CAL-27贴壁细胞接种于载玻片上，药物处理分组如下：空白对照组、白杨素组(10.0 μmol/L)，药物作用时间为48 h。用PBS洗涤后，使用细胞固定剂对细胞进行免疫染色30～60 min，用PBS洗涤，然后添加TUNEL检测液100 μL，对细胞进行1 h避光培育，用PBS洗涤1次，用抗荧光淬灭封片液封片后在荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。

1.5 Western blot印迹法检测Bcl-2及活性Caspase-3蛋白的表达

将对数生长期的CAL-27细胞接种到6孔板上，药物处理分组如下：空白对照组、白杨素组(10.0 μmol/L)，药物作用时间为48 h。将多余培养液全部吸走，PBS预冷洗涤，在低温环境下加入裂解液对细胞进行裂解，充分裂解后，采集细胞裂解液进行离心，提取上清液，使用BCA蛋白定量方法测定蛋白浓度。取相同数量的蛋白和10% SDS-PAGE进行凝胶电泳，60 min后，将凝胶浸于转膜缓冲液10 min后移至PVDF膜，加入封闭剂封闭过夜，加入一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，回收一抗，TBST溶液清洗膜3次，每次10 min；然后加入对应二抗(1∶2 000)孵育30～60 min,PBS清洗，然后显影。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 不同浓度白杨素对CAL-27细胞活力的影响

MTT试验显示：CAL-27细胞经不同浓度白杨素(1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μmol/L)处理24 h后，其细胞增殖活性被抑制(P<0.05)；空白对照组与DMSO组的细胞增殖能力比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。白杨素的IC50值为10.27 μmol/L，故采用浓度为10.0 μmol/L的白杨素用于后续实验。

图1 各组CAL-27细胞活力比较

2.2 细胞形态学改变

空白对照组，即正常舌细胞为梭型，较圆润，分散贴壁生长。白杨素组细胞较扁，体积明显增加，核分裂现象较多，48 h后贴壁不佳，视野范围内可见少数凋亡小体，极少数细胞呈现固缩状态，悬于培养基中(图2)。

a:空白对照组;b:白杨素组

2.3 白杨素对CAL-27细胞凋亡的影响

TUNEL法检测细胞凋亡发现，10.0 μmol/L白杨素显著促进CAL-27细胞凋亡(P<0.05)，而空白对照组与DMSO组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

a:CAL-27细胞凋亡情况；b:视野内阳性细胞数统计 *：与空白对照组比较，P<0.05；#：与DMSO组比较，P<0.05

2.4 白杨素对CAL-27细胞的Bcl-2及Caspase-3表达的影响

Western blot结果显示，白杨素可诱导Bcl-2表达显著下降及Caspase-3活性表达显著上升，但空白对照组与DMSO组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

a:Western blot检测Bcl-2和Caspase-3蛋白表达；b:Caspase-3相对OD值；c:Bcl-2相对OD值 *：与空白对照组比较，P<0.05；#：与DMSO组比较，P<0.05

3 讨论

舌鳞状细胞癌常发生于人面部，除了手术切除，暂无其他合适的临床治疗手段，且手术前后仍需要进行持续的化疗和放疗。目前，临床使用的化疗、放疗不良反应大，许多患者在化疗、放疗过程中需承受巨大痛苦，且治疗效果不佳。因此，研究不良反应轻、易被大众接受的抗口腔鳞状细胞癌药物具有重要意义。白杨素是一种黄酮类化合物，具有明显的抗癌作用[8-11]，可通过诱导癌细胞凋亡等途径实现抗癌作用，值得深入研究。

在细胞的凋亡机制中，处于非常核心地位的Caspase系列蛋白酶可以直接参与凋亡细胞的离散过程。而在细胞凋亡过程中，活性Caspase-3蛋白的表达和细胞凋亡程度紧密相关[12-15]。Bcl-2蛋白则是另一类凋亡调控蛋白，与细胞凋亡也密切相关[16-19]。谢雅馨等[20]通过体外培养口腔鳞状细胞癌KB细胞研究白杨素对细胞凋亡的影响，发现白杨素能够显著抑制KB细胞增殖，诱导其凋亡，且随着白杨素浓度的增加，其抑制增殖及诱导凋亡的作用也会明显增强，提示白杨素抗口腔鳞状细胞癌作用明显，且其机制可能与诱导癌细胞凋亡相关。

本研究选取体外人工培养的舌鳞状细胞癌CAL-27细胞作为实验对象，设立空白对照组和DMSO组，白杨素组给予CAL-27细胞不同浓度的白杨素提取物，采用MTT法检测细胞的生存率，发现CAL-27细胞经不同浓度白杨素(1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μmol/L)处理24 h后，其细胞增殖活性逐渐被抑制，且浓度越高，被抑制的程度越明显，说明白杨素会导致CAL-27细胞活力降低，且具有剂量依赖性；采用倒置光学显微镜观察CAL-27细胞形态发现，空白对照组与白杨素组细胞有明显差异，同时白杨素组出现凋亡小体；TUNEL检测时发现与空白对照组以及DMSO组比较，白杨素组凋亡细胞显著增多，说明白杨素可以诱导CAL-27细胞凋亡；Western blot实验显示，白杨素可显著抑制Bcl-2的表达，增加Caspase-3活性表达，因此，可以初步判断，白杨素通过影响Bcl-2及Caspase-3活性表达对舌鳞状细胞癌的凋亡产生调控作用。结合上述实验结果，本研究初步证明了白杨素可影响舌鳞状细胞癌CAL-27细胞的存活和凋亡，但其具体的作用机制仍需要进一步探讨。

综上所述，白杨素可抑制舌鳞状细胞癌CAL-27细胞增殖，降低细胞活力，并通过调控细胞凋亡蛋白Bcl-2、Caspase-3表达，促进细胞凋亡。