椴树属果实表型性状变异分析及其分类学意义

王欢利， 严灵君， 李迎超， 黄 犀， 张振英， 李常猛， 汤诗杰

(1.江苏省中国科学院植物研究所，江苏省植物资源研究与利用重点实验室， 南京 210014；2.中国林业科学研究院林业研究所， 北京100091；3.青岛抬头生态农业有限公司， 山东 青岛 266100；4.辽宁努鲁儿虎山国家级自然保护区管理局， 辽宁 朝阳 122000)

椴树属(Tilia)属锦葵科(Malvaceae)落叶乔木，分布于亚洲、欧洲和北美洲温带地区[1]。椴树属是构成落叶阔叶林的特征属或者是常绿阔落叶林及针阔混交林的重要伴生种，中国是该属物种多样性中心，主要分布于东北、西南、华中、华东、华北和华南等地[2]。椴树属植物木材致密通直，色白轻软，绢丝光滑，易于加工，可供多种用材使用；韧皮纤维发达，出麻率达39.6%，可做编织和绳索用，同时也是良好的造纸材料；泌蜜量高，气味芬芳，结晶细腻，深受国内外人士青睐；花和叶中含有类黄酮、内酯类和芳香油等，具有治愈呼吸道疾病和促进消化等药用功能；树形优美，寿命长，花香馥郁，叶片对烟尘和有害气体抗性强，开发应用前景十分广泛[3]。

长久以来，分类学家对椴树属形态分类开展了大量研究，但由于椴树属分布范围广、形态变异大，分类过程中种的概念大小不一，不同学者对椴树属的种类划分分歧较大，在23～100种之间[4]。最新修订认为，世界范围内共有23种14变种，同时提出椴属种间形态性状变异和交叉现象广泛存在[5]。上述分类主要依据包括果实、花、叶片、嫩枝、苞片、叶等形态特征。植物表型特征是受自身基因表达和环境影响相互作用的结果。相较于营养器官，生殖器官在植物生命周期中出现得较晚，且出现时间较短，受环境影响小，形态结构也比较稳定。对国内各大标本馆标本的观察发现，椴树属果实的形态是一个相对稳定的性状，并以此为依据将椴树属植物划分为浆果组、壳果组和木果组。此种划分方式被中国学者接受[6]。

果实作为种子植物重要的繁殖器官，也是种子植物形态分类的主要依据[7-9]。果实性状往往是较稳定的遗传特征，是研究植物类群的重要组成部分。椴树属果实的纵径、种子横径、果型系数和百粒重等特征，受采后贮藏条件的影响小，具有直观易辨别和测定的优点。本试验通过有效的采样、合理的数学统计方法，采用遗传学上较为稳定、不易受环境影响的果实性状来揭示椴树属类群间，群体间及个体间变异大小，以区别和鉴定物种和品种，进而为探讨椴树属物果型成与分化机制作必要的准备。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在项目组2017—2019年广泛调研和资源收集的基础上，选择胸径15 cm以上，树体生长旺盛的3个及以上的天然实生优树，于秋季分株采集结果主枝上果实；同时收集2018年青岛抬头生态农业有限公司引进的欧洲及美洲椴树属种子共4份。各果实来自我国黑龙江、辽宁、安徽、江苏、山东、吉林6省(表1)，均为具一定代表性的天然或栽培种质，包括紫椴(TiliaamurensisRupr.)3份、糠椴(TiliamandshuricaMaxim.)3份、糯米椴(Tiliahenryana)3份、南京椴(TiliamiquelianaMaxim.)16份、欧洲小叶椴‘绿塔’(TiliacordataMill ‘Greenspire’)1份、欧洲大叶椴‘泽栽特’(TiliaplatyphyllosStop. ‘Zelzate’)1份、银毛椴‘斯特灵’(TiliatomentosaMoench ‘Sterling’)1份、美洲椴‘哨兵’(Tiliaamericana‘Sentry’)1份，每份果实样品不小于1 kg。将29份样品充分阴干，4 ℃冰箱保存备用。

表1 椴树属种质资源基本信息

1.2 试验方法

1.2.1表型性状测定

采用四分法随机抽取果实30粒，重复3次。使用电子游标卡尺(精度0.02 m)分别测量果实的横、纵，侧径；每份种质随机选取100粒果实称其重量，重复3次，取平均值[10]。

果型指数=果实纵径/果实横径；

变异系数(%)=(标准差/平均值)×100%。

1.2.2数据处理

采用Microsoft Excel 2010软件整理统计数据，运用R 3.3.3软件进行数据分析。计算各性状的最大值、最小值、均值、标准差和极差等；采用箱式图进行离群值的检测；对分组数据进行正态分布检测和方差齐性检测，采用Shannon-Wiener多样性指数(H′)表征果实性状的多样性程度，计算参试材料的平均数(μ)和标准差(σ)，将目标性状均划分为10个等级，其中(μ-2σ)≤xi(μ-2σ)每隔0.5σ为一级，计算每一级相对频率pi(pi为某性状第i级别材料数占总份数的百分比)，计算公式为：

H′=-∑pilnpi[11]；

采用巢式设计方差分析并计算方差分量及表型分化系数，线性模型为：

Yijk=u+τi+δj(i)+εk(ij)，式中，Yijk为第i个种群(物种)第j个单株(个体)，第k个测定值，u为总平均值，τi为种群间(物种间)效应，δj(i)为种群内(物种)基因型效应值，εk(ij)为随机误差[12]；

对采集的种群进行表型分化系数，计算公式为：

采用非参数Kruskal-Wallis检验法对 29个种质进行均值比较；采用双变量相关分析对果实表型形状进行相关分析，并采用pearson法进行相关系数的检验；果实性状数据经标准化后，选用hclust()函数采用ward最小方差准则进行聚类分析[14]。

2 结果与分析

2.1 椴树属果实性状变异及多样性分析

采用果实横径、果实纵径、果型指数、果实百粒重4个表型性状，分析椴树属各物种的果实性状变异情况。研究发现，南京椴变异系数在7.06%～20.23%之间，其中果实的百粒重变异最大，果实纵径变异最小。比较南京椴群体间变异系数发现，南京椴牛首山群体果实性状变异系数高于皇藏峪和铁山寺群体。椴树属变异系数在14.07%～50.93%之间，其中果实的百粒重变异最大，果实纵径变异最小。比较各物种间变异系数，发现果实横径变异系数在7.5%～11.71%之间，依次为紫椴<糠椴<美洲椴<银毛椴<糯米椴<南京椴<欧洲小叶椴<欧洲大叶椴；果实纵径变异系数在5.12%～14.78%之间，依次为紫椴<南京椴<糯米椴<糠椴<欧洲小叶椴<银毛椴<美洲椴<欧洲大叶椴；果型指数变异系数在6.94%～13.99%之间，依次为糠椴<南京椴<糯米椴<紫椴<美洲椴<欧洲小叶椴<银毛椴<欧洲大叶椴；果实百粒重变异系数在0.55%～20.23%之间，依次为欧洲小叶椴<银毛椴<欧洲大叶椴<美洲椴<糯米椴<糠椴<紫椴<南京椴。

果实性状不同程度地体现了椴树属内的多样性，研究结果表明，南京椴群体果实性状多样性指数在1.896～2.076之间，其中果实的百粒重多样性指数椴树属群体高于南京椴群体，果实横径、果实纵径和果型指数3个性状多样性指数椴树属群体低于南京椴群体。各居群间果实4个性状多样性比较发现，牛首山群体>皇藏峪群体>铁山寺群体。椴树属果实性状多样性指数在1.682～2.094之间。比较各性状多样性指数发现，果实横径>果实纵径>果实百粒重>果型指数。分析椴树属各物种间多样性指数，发现果实横径多样性指数在1.890～2.094之间，依次为欧洲小叶椴<欧洲大叶椴<银毛椴<美洲椴<糯米椴<糠椴<南京椴<紫椴；果实纵径多样性指数在1.906～2.082之间，依次为欧洲大叶椴<美洲椴<欧洲小叶椴<糯米椴<糠椴<银毛椴<南京椴<紫椴；果型指数多样性在1.835～2.057之间，依次为糯米椴<银毛椴<欧洲小叶椴<欧洲大叶椴<糠椴<美洲椴<南京椴。

表2 椴树属种子表型性状统计分析

2.2 椴树属野外群体间表型分化及个体形态特征变异来源

分别采用巢式设计方差分析研究南京椴群体间和群体内以及椴树属物种间和物种内两个层次上果实性状差异的显著性，结果见表3。南京椴群体间仅果实百粒重性状呈显著差异(p<0.05)；而果实横径、纵径和果型指数无明显差异；南京椴群体内不同个体间(基因型)果实4个性状均呈现显著差异(p<0.05)，其中果实横径、果实纵径、果型指数差异达极显著(p<0.01)水平，说明南京椴群体间的差异较小，而群体内(个体间)存在广泛的差异。椴树属4个物种间果实4个性状均存在显著差异(p<0.05)，其中果实纵径、果型指数及果实百粒重差异达极显著水平(p<0.01)，椴树属各物种果实的4个性状均存在显著差异(p<0.05)，其中果实纵径、果型指数和果实百粒重差异达到极显著水平(p<0.01)，说明椴树属物种间和种內均存在广泛的差异。

表3 种子性状的方差分析

按照巢式设计方差分量比组成，进一步分析出各方差分量占总变异的比例。由表4可以看出，南京椴果实横径和果型指数表型分化系数范围为0.02%～69.74%，群体内的表型变异大于群体间表型变异，其中南京椴果实横径性状最为稳定；果实百粒重表型分化系数79.25%，群体间变异大于群体内变异。椴树属果实性状表型分化系数范围为76.76%～83.72%，物种间变异大于物种内变异。

表4 方差分量与表型分化系数

2.3 椴树属果实性状多重比较

对椴树属8个物种29个单株的4个果实性状进行多重比较，结果如图1～图4所示。不同单株间果实横径、果实纵径、果型指数和果实百粒重差异显著(p<0.01)，其中南京椴牛首山群体3号和8号单株以及糠椴20号和22号单株果实横径均值较高，糯米椴23、24、25号单株以及欧洲小叶椴26号单株均值较低；铁山寺群体14、15、16号单株以及糠椴20号单株果实纵径的均值较高，紫椴17、18、19号单株以及欧洲小叶椴26号单株均值较低；紫椴17，18、19号单株果型指数均值较高，南京椴铁山寺群体14、15、16号单株均值较低；南京椴铁山寺群体14、15、16号单株果实百粒重均值较高，紫椴17、18、19号单株以及欧洲小叶椴26号单株均值较低。

注：不同小写字母代表群体间差异达到了显著水平(p<0.05)，横坐标1～29代表椴树属29份种质。下同。

图2 椴树属29个单株种子纵径多重比较

图3 椴树属29个单株果型指数多重比较

图4 椴树属29个单株种子百粒重多重比较

2.4 椴树属果实性状相关性分析

对椴树属果实横径径、果实纵径、果型指数及果实百粒重进行相关分析，结果如表5所示。果实横径与果实纵径和果实百粒重呈极显著(p<0.01)正相关，相关系数分别为0.51和0.96；果实的横径与果型指数呈极显著(p<0.01)负相关，相关系数为-0.63。果实纵径与果型指数和果实百粒重呈及显著正相关(p<0.01)，相关系数分别为0.03和0.48。果型指数与果实百粒重呈现极其显著的正相关(p<0.01)，相关系数为0.62。

表5 椴树属种子表型性状间的相关分析

2.5 椴树属果实性状聚类分析

基于椴树属果实纵径、果实横径、果型指数和果实百粒重，对供试的29个单株(基因型)进行聚类分析，结果见图5。29份椴树属种质可划分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 三组。Ⅰ组共20份种质，进一步可划分为A和B两个亚组；其中A亚组6份种质，包含南京椴铁山寺群体3份种质(14～16号)、南京椴牛首山2份种质(7、10号)和糠椴1份种质(20号)，B亚组14个基因型，包含南京椴牛首山群体9份种质(1～6，8、9号)，南京椴皇藏峪群体3份种质(11～13号)，糠椴2份种质(21、22号)和美洲椴1份种质(29号)。Ⅱ组共5份种质，分别为糯米椴3份种质(23～25号)、欧洲大叶椴1份种质(27号)和银毛椴1份种质(28号)；Ⅲ组共4份种质，包含紫椴3份种质(17～19号)和欧洲小叶椴1份种质。

图5 基于种子表型性状的椴树属种质聚类分析

3 讨论与结论

植物的表型性状可以直观地反映其遗传多样性，并且与根、茎、叶等营养器官相比，种子的表型性状较为稳定，常被用作分类学指标，且更适于阐述植物的遗传多样性。本研究发现，椴树属各物种及南京椴群体果实性状变异丰富。其中果实百粒重变异系数较高，分别为50.93%和20.23%，果实纵径、横径和果型指数变异较小。这可能是由于椴树属及南京椴果实的形态指标较为稳定，较少受到环境的影响，而果实百粒重为产量指标，为数量性状，遗传不稳定，与环境差异和个体间基因型的影响较大。同时比较果实性状多样性指数时，发现椴树属和南京椴群体果实百粒重多样指数均小于果实纵径、横径和果型指数等形态指标，可能是由于多样性指数是对性状丰富度和均匀度的综合评价，表型性状越丰富且分布越均匀，多样性指数越高[15]。研究还发现，椴树属4个果实性状多样性指数均小于南京椴群体；而椴树属果实性状的变异系数均大于南京椴群体。多样性指数和变异系数结论不一致。这可能是由于在果实表型性状测量和统计过程中，椴树属内各物种取样不均衡，南京椴样本数目明显高于属内其他物种，导致属内果实性状分布的均一性降低；同时在计算果实百粒重时样本量仅为其他3个表型性状样本量的十分之一，在一定程度上降低该性状的丰富度。

巢式方差分析结果表明，南京椴果实横径、果实纵径及果型指数仅在群体间存在显著差异，果实百粒重在群体间及群体内均呈显著差异。方差分量比及表型分化系数结果显示，南京椴果实纵径、横径和果型指数3个形状指标变异主要来源于群体内，群体内的多样性大于群体间的多样性，此结果与ISSR及RAPD的遗传标记分析从南京椴群体遗传多样性的结果一致，原因可能是南京椴为异花授粉植物，群体内存在广泛的基因交流，导致高度的杂合性，从而提高了群体内的遗传多样性，同时也解释了表型多样性是在形态水平上对遗传多样性进行的阐述[16-17]。

椴树属物种间果实性状的变异主要来自物种间，表型分化系数在76.76%～83.72%，说明椴树属果实形态差异主要来自于物种间，个体内的分化系数较小，同时也揭示了果实作为繁殖器官，受基因环境的交互作用影响较小，更适宜作为分类学指标。

相关性分析结果表明，南京椴果实百粒重与果实的横径和纵径均呈极显著的正相关(p<0.05)，说明果实横径和纵径对果实百粒重影响很大。聚类分析结果表明，在横线处19个单株被划分为3类，其中第一类为木果组(南京椴和糠椴)，为大果型，果皮木质较厚、坚硬，种子的发芽率较低[18-19]；第二类是木果组(糯米椴、美洲椴和银毛椴)，为小果性，果皮稍薄、坚硬，种子发芽率较低；第三类为壳果组(紫椴和欧洲小叶椴)，为小果型，果皮薄，受轻度机械压力开裂，种子的发芽率较高。值得注意的是，各单株的聚类结果与种属关系及地理分布并未重合，存在一定的交叉和混杂现象，这可能由于椴树属内缺乏生殖隔离，种间存在着广泛的基因交流，造成了性状特征的交错，这也给椴树属分类造成了一定的困难。同时植物的表型特征是受基因和环境共同作用的结果，种质采集地的地形、土壤和气候等因子及植被类型的差异都可能是变异的来源。

综上所述，椴树属果实性状变异丰富，属内变异主要来源于物种间，南京椴种内变异主要来源于群体内。依据果实的性状可将椴树属物种划分为壳果组、木果组大果型和木果组小果型三类，与椴树属经典分类学结果基本一致。此外，本研究过程中由于椴树属野外群体大多成岛状分布，部分个体结实率低、种子采集困难，造成样本数量偏低，同时欧洲小叶椴、欧洲大叶椴、银毛椴及美洲椴等样本，主要采自栽培品种，变异系数较小且无法评估群体内的差异。在后续的研究中可以通过连年的取样，并扩大样本和物种数量，同时进一步增加果实性状参数，消除采样及测试过程中的误差，更加系统地揭示椴树属果实及种子性状变异规律，进而推动椴树属物种的形态学分类及选择育种的发展。