人工老化和引发处理对菘蓝种子活力及生理特性的影响

陈东亮， 钟 楚， 简少芬， 韦坤华， 李万银， 缪剑华

(广西壮族自治区药用植物园广西药用资源保护与遗传改良重点实验室/广西壮族自治区药用植物园/广西壮族自治区中药资源智慧创制工程研究中心， 南宁 530023)

菘蓝(IsatisindigoticaFort.)为十字花科(Brassicaceae)菘蓝属药用植物，又名茶蓝、板蓝根、大青叶等。菘蓝茎直立，绿色，顶部多分枝，植株光滑无毛，带白粉霜，根(板蓝根)、叶(大青叶)均供药用，有清热解毒、凉血消斑、利咽止痛的功效。叶还可提取蓝色染料；种子榨油，供工业用[1]。菘蓝属大宗中药材，全国各地均有栽培[2]。近年来，菘蓝的种植面积以及种子的需求量也有所提高。而高活力的种子是中药材规模化种植的前提和有效保证。

药用植物种子活力的高低直接反映了该植物在田间生产的出苗率和出苗时间，影响药材的产量和质量，间接决定了中药材生产效率和生产成本。然而，种子在贮藏过程中受种子本身含水量、贮藏温度、贮藏空间相对湿度、生物因素及贮藏时间等诸多因素的影响，会发生不可逆的劣变衰老现象，导致活力降低[3-4]。种子劣变的外在表现为萌发率降低、出苗延迟、一致性降低、幼苗生长异常，最终导致产量和生产效率降低[5]，给农业生产带来巨大损失。同时种子内部还伴随着一系列复杂的生理生化反应，如蛋白质合成障碍、DNA损伤、基因表达紊乱、营养物质分解、细胞组织损伤、次生代谢物质积累及抗氧化酶系统活性降低等[6-8]。由于种子自然老化需要较长的时间，为了便于研究，Rajjou等[9]提出了人工加速老化的方法。种子引发技术是基于种子萌发的生物学机制提出的[10]。主要通过渗透调节、温度调节、气体调节和激素调节等方式促进种子萌发，并且提高萌发时间的稳定率和萌发整齐率，减小萌发时间的标准差，提高苗的抗性和素质、改善营养状况，是一种提高老化种子萌发的有效途径[11]。抗坏血酸(AsA)[12-13]、水杨酸(SA)[14-15]、聚乙二醇(PEG-6000)[16-18]、赤霉素(GA3)[13,19-20]、双氧水(H2O2)[21-22]等种子引发剂被广泛应用于农业领域。然而，目前对菘蓝种子的老化规律及种子活力修复的研究却鲜有报道。

本研究利用人工加速老化的方法对菘蓝种子进行不同程度的老化处理，测定不同老化程度的菘蓝种子发芽情况和抗氧化系统酶活性，并用不同引发剂对人工加速老化的种子进行引发处理，分析其萌发特性，旨在探索人工老化和不同引发剂引发处理对菘蓝种子萌发特性及生理特性的影响，以期为菘蓝种子安全贮藏、高效率育苗和人工栽培提供科学指导，为菘蓝种子老化机理研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

菘蓝种子是2019年从河北保定收获的地方品种。采集后经阴干、筛选，获得净种子(百粒重0.270 4 g，含水量8%)。置于4 ℃冰箱中保存，2020年9月做人工老化处理及相关实验。

1.2 方 法

1.2.1人工老化处理

在玻璃干燥器底部装入适量清水，盖好盖子后置于恒温烘干箱内，打开烘箱，调至45 ℃，待容器内温度和相对湿度分别稳定在45 ℃和100%时，将供试种子均匀的摊置于尼龙纱网袋内，将网袋置于容器内，盖好容器盖，关闭烘箱箱门，开始计时。在该条件下进行人工加速老化处理2 d(A 2 d)和4 d(A 4 d)，以不做老化处理的种子作对照(ck)。处理完成后立即进行引发处理。

1.2.2引发处理

将ck和老化处理后的菘蓝种子分别用抗坏血酸(0、200 mg·L-1、400 mg·L-1、600 mg·L-1)、PEG-6000(0、10%、20%、30%)和GA3(0、200 mg·L-1、400 mg·L-1、600 mg·L-1)溶液浸种24 h，ck组用蒸馏水浸种。浸种结束后，用去离子水将残留在种子表面的引发剂充分漂洗干净。

1.2.3种子发芽试验

在直径为9 cm的一次性培养皿内平铺3层定性滤纸，用蒸馏水充分湿润滤纸作为发芽床。用70%酒精对种子进行表面消毒2 min，在发芽床上等距离置床100粒种子，置于温度为25 ℃，光强为5 000 lx，光照周期为12 h光/12 h暗的恒温光照培养箱内。种子萌发期间始终保持发芽床湿润。置床后第2天统计发芽势，第7天统计总发芽率、下胚轴长(cm)及初生根长(cm)。每个处理3次重复，每重复1皿。

1.2.4生理指标测定

取0.2 g样品置于预冷的研钵中，加入2 mL 50 mmol·L-1的磷酸缓冲液(pH=7.8)，研磨成匀浆，转入离心管中，4 ℃ 12 000 g下离心20 min，上清液为待测酶液。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性参照李合生[23]的方法进行测定。每个处理3次重复。

1.2.5数据分析方法

用Excel 2007软件进行数据整理，用IBM SPSS 20.0软件的单因素方差分析法(LSD法)对实验数据进行显著性检验和多重比较分析。

2 结果分析

2.1 老化对菘蓝种子发芽特性的影响

菘蓝种子经老化处理后，随着老化天数的增加，其发芽率、发芽势、下胚轴长和主根长变化趋势基本一致，即随着老化程度的加深而逐渐降低(图1)。其中，ck的发芽势、发芽率、下胚轴长及主根长分别为53.33%、73.33%、3.43 cm和1.39 cm。A 2 d的发芽势、发芽率和下胚轴长分别减小至10.67%、58.00%和2.52 cm，且均达极显著水平(p<0.01)；A 4 d与ck相比，发芽势、发芽率、下胚轴长和主根长分别减小至2.00%、19.33%、1.04 cm和0.42 cm，且差异均达极显著水平(p<0.01)。

2.2 老化对菘蓝种子生理特性的影响

从图2可以看出，SOD、POD和CAT活性变化的趋势基本一致，其活性均随着老化程度的加深而逐渐降低。未经老化处理的菘蓝种子SOD活性为245.53 U·g-1，A 2 d和A 4 d的菘蓝种子SOD活性分别降低至198.46 U·g-1和173.35 U·g-1，差异达显著水平(p<0.05)。未经老化处理的菘蓝种子POD活性为2 022.95 U·(g·min)-1，A 2 d和A 4 d的菘蓝种子POD活性分别降低至1 260.53 U·(g·min)-1和396.43 U·(g·min)-1，差异达极显著水平(p<0.01)。未经老化处理的菘蓝种子CAT活性为3 626.21 U·(g·min)-1，A 2 d和A 4 d的菘蓝种子CAT活性分别降低至2 959.01 U·(g·min)-1和1 375.60 U·(g·min)-1，差异达极显著水平(p<0.01)。

2.3 引发处理对老化菘蓝种子萌发特性的影响

2.3.1AsA引发对老化菘蓝种子发芽特性的影响

由图3可以看出，与ck相比，200 mg·L-1、400 mg·L-1和600 mg·L-1的AsA溶液引发均能使未经老化(ck)的菘蓝种子发芽势从53.33%分别提高到64.67%、79.33%和66.67%，且差异均达极显著水平(p<0.01)。400 mg·L-1和600 mg·L-1的AsA溶液引发均能使ck的菘蓝种子发芽率从73.33%分别提高92.67%和90.00%，且差异均达极显著水平(p<0.01)。

由图3可知，与ck相比，200 mg·L-1、400 mg·L-1和600 mg·L-1的AsA溶液引发均能使人工加速老化2 d(A 2 d)的菘蓝种子发芽势从10.67%分别提高到30.00%、52.67%和58.67%，且差异均达极显著水平(p<0.01)。400 mg·L-1和600 mg·L-1的AsA溶液引发均能使人工加速老化2 d(A 2 d)的菘蓝种子发芽率从58.00%分别提高到70.67%和76.67%，且差异均达极显著水平(p<0.01)。

由图3可知，与ck相比，200 mg·L-1、400 mg·L-1和600 mg·L-1的AsA溶液引发均能使人工加速老化4 d(A 4 d)的菘蓝种子发芽势从2.00%分别提高到9.33%、21.33%和31.33%，且差异均达极显著水平(p<0.01)。400 mg·L-1和600 mg·L-1的AsA溶液引发均能使人工加速老化4 d(A 4 d)的菘蓝种子发芽率从19.33%分别提高到37.33%和44.67%，且差异均达极显著水平(p<0.01)。

综上，200 mg·L-1、400 mg·L-1和600 mg·L-1的AsA溶液引发均能显著提高ck和经人工加速老化处理2 d(A 2 d)、4 d(A 4 d)的菘蓝种子的发芽势。而400 mg·L-1和600 mg·L-1的AsA溶液引发则可极显著提高ck和经人工加速老化处理2 d(A 2 d)、4 d(A 4 d)的菘蓝种子的发芽率。

2.3.2PEG-6000引发对老化菘蓝种子发芽特性的影响

从图4可以看出，用浓度分别为10%和30%的PEG-6000溶液引发后，菘蓝种子发芽率分别为70.66%和74.67%，与ck处理的菘蓝种子发芽率73.33%相比无显著差异。而当被浓度为20%的PEG-6000溶液引发后，发芽率极显著高于ck(p<0.01)，为86.33%。从发芽势分析，用浓度为20%的PEG-6000溶液引发后，发芽势上升至70%，高于ck处理的菘蓝种子53.33%，差异达极显著水平(p<0.01)。10%的PEG-6000溶液引发处理后，发芽势与ck无显著差异，30%的PEG-6000溶液引发处理后，发芽势显著低于ck。结果表明，20%浓度的PEG-6000溶液引发可提高菘蓝种子发芽率和发芽势。

由图4可见，老化处理2 d的菘蓝种子发芽率为58%，经浓度为10%的PEG-6000溶液引发后，发芽率与未经引发剂处理的A 2 d的菘蓝种子相比无显著差异，为64.67%，当用浓度为30%的PEG-6000溶液引发处理后，发芽率为66%，显著高于未经引发剂处理的A 2 d的菘蓝种子(p<0.05)。当用浓度为20%的PEG-6000溶液引发后，发芽率极显著高于未经引发剂处理的A 2 d的菘蓝种子(p<0.01)，为71.67%，从发芽势上分析，A 2 d的菘蓝种子发芽势为10.67%，当用浓度为20%的PEG-6000溶液引发后，发芽势极显著高于未经引发剂处理的A 2 d的菘蓝种子(p<0.01)，上升至22.67%。结果表明，20%浓度的PEG-6000溶液引发可提高经45 ℃高温、100%高湿老化处理2 d的菘蓝种子发芽率和发芽势。

由图4可见，A 4 d的菘蓝种子发芽率仅为19.33%，当用浓度为10%和30%的PEG-6000溶液引发后，发芽率均与ck无显著差异，分别为14.66%和22%，当用浓度为20%的PEG-6000溶液引发后，发芽率极显著高于ck(p<0.01)，上升至29.33%。从发芽势上分析，老化处理2 d的菘蓝种子发芽势仅为2%，当用浓度为20%的PEG-6000溶液引发后，发芽势极显著高于ck(p<0.01)，上升至9.3%。而用浓度为10%和30%的PEG-6000溶液引发后，发芽势均与ck无显著差异，分别为3.66%和3%。结果表明，20%浓度的PEG-6000溶液引发可提高经45 ℃高温、100%高湿A 4 d的菘蓝种子发芽率和发芽势。

综上，20%的PEG-6000溶液引发可显著提高未经老化处理(ck)和经45 ℃高温、100%高湿老化处理2 d(A 2 d)、4 d(A 4 d)的菘蓝种子发芽率和发芽势。

2.3.3GA3引发对老化菘蓝种子发芽特性的影响

由图5可见，200 mg·L-1、400 mg·L-1的GA3溶液引发均能使菘蓝种子发芽势从未经老化(ck)的53.33%分别提高到62.00%和76.00%，且差异分别达显著(p<0.05)和极显著水平(p<0.01)。200 mg·L-1和400 mg·L-1的GA3溶液引发均能使未经老化(ck)的菘蓝种子发芽率从73.33%分别提高到88.67%和94.67%，且差异均达极显著水平(p<0.01)。

由图5可知，与ck相比，200 mg·L-1和400 mg·L-1的GA3溶液引发均能使经人工老化2 d(A 2 d)的菘蓝种子发芽势从10.67%分别提高到40.00%和40.62%，且差异均达极显著水平(p<0.01)。200 mg·L-1和400 mg·L-1的GA3溶液引发均能使经人工老化2 d(A 2 d)的菘蓝种子发芽率从58.00%分别提高到71.33%和80.00%，且差异均达极显著水平(p<0.01)。

图5可知，与ck相比，400 mg·L-1的GA3溶液引发能使经人工加速老化4 d(A 4 d)的菘蓝种子发芽势从2.00%提高到10.67%，且差异达极显著水平(p<0.01)。200 mg·L-1和400 mg·L-1的GA3溶液引发均能使经人工加速老化4 d(A 4 d)的菘蓝种子发芽率从19.33%分别提高到36.00%和42.00%，且差异均达极显著水平(p<0.01)。

综上，200 mg·L-1和400 mg·L-1的GA3溶液引发可显著提高未经老化(ck)和经人工加速老化2 d(A 2 d)的菘蓝种子发芽势和发芽率，同时可显著提高经人工加速老化4 d(A 4 d)的菘蓝种子发芽率，而400 mg·L-1的GA3溶液引发可显著提高经人工加速老化4 d(A 4 d)的菘蓝种子发芽势。

3 讨 论

一般自然条件下种子衰老时间长达数年甚至数十年，研究种子老化特征及种子耐贮性较为困难。通过人工加速老化的方法可快速预测种子的耐贮性[24]。种子处在高温、高湿的密闭环境下，一方面无氧呼吸作用会加快，产生酒精和CO2，酒精积累过多对种胚有毒害作用[9,25]；另一方面，种子内贮藏物质和能量消耗的加剧[26]，导致种子现有的物质代谢和能量代谢供应减少，难以满足种子正常萌发所需的物质代谢和能量代谢需求，抑制了种胚正常发育以及幼苗正常生长，最终导致种子发芽率、发芽势、种子活力、发芽指数等萌发指标下降，幼苗矮小。在人工加速老化过程中，一般老化处理时间越长、温度越高、湿度越大，种子劣变速度越快，萌发指标下降也就越快。吴汉花等[27]在高温(42 ℃)高湿(相对湿度100%)条件下，分别人工老化处理十字花科植物不结球白菜种子2 d和4 d后，其发芽率比ck分别降98.63%和89.04%。而本研究将菘蓝种子置于45 ℃和100%相对湿度的密闭条件下，分别老化处理2 d和4 d后，发芽率分别降低至ck的79.1%和26.36%。老化4 d的菘蓝种子发芽率仅为19.3%。而Jiang F L等[25]的研究表明，在42 ℃高温和100%高湿条件下，分别老化处理十字花科植物大白菜种子2 d和4 d后发芽率分别降低至对照的81.88%和18.12%，与本研究结果较为一致。

种子老化过程往往伴随着膜脂过氧化，保护酶活性下降，蛋白质降解，相关基因调控通路紊乱以及遗传物质降解等生理生化反应[28]。种子抗氧化系统酶活性降低是导致种子劣变的主要原因之一[16]。研究表明，水稻[31]、玉米[32]、小麦[33]、大豆[34]、棉花[35]、油菜[36]等农作物种子贮藏过程中SOD、POD和CAT等酶活性逐渐降低。本研究结果表明，随着老化进程的不断加深，菘蓝种子SOD、POD和CAT活性显著降低。因此，对菘蓝种子SOD、POD和CAT活性检测可间接预测菘蓝种子老化程度，对菘蓝种子质量评价具有重要意义。

种子在贮藏过程中伴随着的衰老劣变现象虽不可避免，但可通过种子引发技术进行活力修复。已有大量研究认为，老化的野菊花[16]、白菜[17]、远志[18]、燕麦[37]、紫苏[38]、大麦[39]、玉米[40]等种子经PEG引发后活力提高[41]。本研究表明，未经老化处理的菘蓝种子经20%的PEG引发后发芽率提高了17.80%，与孟静静等[42]研究结果相符。研究认为，AsA引发和GA3[13,19-20]引发可提高某些植物老化种子的活力，与本研究结果也不尽相同。本研究发现的菘蓝种子老化规律及老化种子活力修复方法可为菘蓝种子的安全贮藏提供一定的理论参考，为提高菘蓝种子活力提供实验基础。