不同活力烟草种子抗氧化酶活性差异与相关性分析

王国平， 潘 威， 牛永志， 古 吉， 周东洁， 郑昀晔,2

(1.玉溪中烟种子有限责任公司，云南省烟草种子工程技术中心， 云南 玉溪 653100；2.云南省烟草农业科学研究院， 云南 玉溪 653100)

种子功能的一个关键组成部分是种子活力。种子活力决定了种子发芽迅速、整齐的能力。高活力的种子表现出发芽率高、萌发速度快、出苗整齐度高、幼苗生长旺盛、抗逆性强等特点，对于提高作物资源利用率和保障后期产质量具有重要意义[1]。

烟草是重要的经济作物，在我国农业生产中具有重要地位，为发展地方经济、增加国家财政收入做出了巨大的贡献。烟草种子是烟叶生产的源头，提高种子质量，保障“两烟”生产，一直是行业普遍关心的问题。目前，烟草种子活力主要是通过萌发过程中的发芽指标(发芽率、发芽势、发芽指数)来评价，这也是最普遍最直接的评价方法之一。但该方法也存在检测时间较长，不能全面、准确反映种子质量的缺陷，因此，开展烟草种子活力评价方法的筛选十分必要。

活性氧(ROS)是指分子氧的单电子还原后产生的一类代谢产物和衍生物，主要包括超氧阴离子自由基(O2·-)、羟基自由基(·OH)、过氧化氢(H2O2)等[2]。ROS参与种子休眠、萌发、逆境胁迫等生物学过程[3]。作为信号分子，ROS与脱落酸(ABA)和赤毒素(GA)存在交互作用[4-5]。而ABA和GA的平衡在调控种子休眠与萌发中发挥主导作用，ABA促进和维持种子休眠，GA促进种子萌发和拮抗ABA的抑制作用[6]。此外，ROS与其他激素，如：细胞分裂素(CKs)、水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、乙烯也存在交互作用，间接调控种子萌发[7]。植物体细胞内ROS的产生和清除处于一种动态平衡，当ROS水平过高时，又会转变为毒害分子，造成膜脂过氧化，导致膜的组分和结构发生变化。过量的ROS可以通过包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)等的抗氧化酶系统清除[8]。

ROS在种子生活史发挥重要作用，关于种子成熟[9]、萌发[10-11]、贮藏[12]等阶段的抗氧化酶的变化研究也有很多报道。本研究从不同活力种子角度，探讨不同活力种子萌发和幼苗建成阶段的抗氧化酶差异以及变化情况，期望筛选到抗氧化酶反映种子活力大小的最佳方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选用不同活力的烟草种子，分别为2008年采收、精选的MS云烟85种子(编号：MS云烟85-H)和2001年采收、未精选的MS云烟85种子(编号：MS云烟85-L)。种子来源于玉溪中烟种子有限责任公司种子库。

1.2 实验方法

1.2.1发芽指标测定

利用置种仪将种子播到垫有用自来水湿润的海绵和滤纸的培养皿(加盖)上，每皿100粒，3次重复。将培养皿置于25 ℃、光照为12 h的恒温恒湿培养箱中培养14 d，培养过程中定期补充水分保持滤纸湿润。从第4天开始，每天统计发芽数量。发芽的标准为：胚根长度达种子长度的两倍。

发芽率(%)=(第14天供试种子的发芽数/供试种子总数)×100%；

发芽势(%)=(第7天供试种子的发芽数/供试种子总数)×100%；

发芽指数=∑(Gt/Dt)，Gt为t日的发芽数，Dt为发芽天数。

1.2.2抗氧化酶活性测定

测定不同活力种子萌发1 d、2 d、3 d、4 d、5 d的CAT、SOD和POD活性。称取0.05 g干种子，利用试剂盒(分光光度法)测定酶活性，试剂盒购买于北京索莱宝科技有限公司。生理生化指标测定过程中因操作产生的误差较大，应多做重复，选择稳定性较好的3个重复作为最终实验数据。

2 结果与分析

2.1 不同活力烟草种子发芽特性分析

种子活力检测最常用、最直接的方法是测定发芽特性。本研究检测了不同活力烟草种子MS云烟85-H和MS云烟85-L的发芽情况。结果显示，MS云烟85-H在第4天大部分已经发芽，而MS云烟85-L在第4天刚刚开始发芽。从第4天到第7天每天的发芽数量变化较大，到第7天以后每天的发芽数量基本稳定(图1 B)。MS云烟85-H的发芽率为97.67%，发芽势为96.33%，发芽指数为19.16；MS云烟85-L的发芽率为83.33%，发芽势为79.00%，发芽指数为15.18(表1)。在发芽率、发芽势、发芽指数上，MS云烟85-H和MS云烟85-L之间均达到了极显著差异，活力高的种子发芽率高、发芽速度快，在发芽指标方面表现出明显的优势。另外，活力高的种子胚根更长，幼苗更大(图1 A)，在幼苗素质方面也表现出优势。

注：A为不同活力烟草种子发芽过程；B为不同活力烟草种子每天发芽情况。

表1 不同活力烟草种子发芽指标

2.2 种子萌发过程中抗氧化酶活性分析

在萌发过程中，MS云烟85-H的CAT酶活性整体呈现先升高后降低的趋势，在第2天略微下降，第4天达到顶峰，第5天迅速下降，第4天与其他处理差异显著，第3天与第1、2、5天差异显著，第1、2、5天之间差异不显著。MS云烟85-L的CAT酶活性持续升高，第4天和第5天之间差异不显著，与其他处理间差异显著，第3天与第2天差异不显著，与第1天差异显著，第2天与第1天差异不显著(图2，表2)。MS云烟85-H的SOD酶活性呈先升高后降低的趋势，第4天达到顶峰，第5天迅速下降，第4天与其他处理差异显著，其他处理之间差异不显著。MS云烟85-L的SOD酶活性持续升高，第5天与其他处理差异显著，第4天与第3天差异不显著，与第1、2天差异显著，第3天与第1、2天差异不显著(图3，表2)。MS云烟85-H的POD酶活性呈持续升高，第5天与其他处理差异显著，第4天与第1、2、3天差异显著，第3天与第1、2天差异显著，第1天和第2天差异不显著。MS云烟85-L的POD酶活性呈持续升高，第5天和第4天差异不显著，与其他处理差异显著，其他处理间差异不显著(图4，表2)。

图2 不同活力烟草种子萌发过程中CAT酶活性变化

图3 不同活力烟草种子萌发过程中SOD酶活性变化

图4 不同活力烟草种子萌发过程中POD酶活性变化

本研究中的萌发阶段指的是从种子吸胀到幼苗子叶完全展开。按照萌发天数来看，活力较高的种子CAT和SOD酶活性前3 d内先缓慢升高，第4天迅速升高，到第5天后迅速下降，POD酶活性前3 d内先缓慢升高，到第4天和第5天迅速升高；活力较低的种子CAT、SOD和POD酶活性持续升高，速度相对平缓。按照种子发芽生物学过程来看，无论是第4天的高活力种子还是第5天的低活力种子，这一时期正是完成胚轴伸长和胚根突出的时期，所以，CAT和SOD酶活性在萌发过程中先不断升高，直到完成胚轴伸长和胚根突出，而后下降，POD酶活性则不断升高。

2.3 不同活力种子抗氧化酶活性分析

在不同活力种子方面(表2)，MS云烟85-H的CAT酶活性在前4天均高于MS云烟85-L，第1天差异极显著，第2天差异不显著，第3天和第4天差异显著；MS云烟85-H的CAT酶活性在第5天低于MS云烟85-L，且达到显著水平。在第4天，MS云烟85-H的CAT酶活性高于MS云烟85-L，且差异达到最大，所以可以选用第4天的CAT酶活性反映种子活力。MS云烟85-H的SOD酶活性在第1天和第5天低于MS云烟85-L，且第1天差异不显著，第5天差异显著；MS云烟85-H的SOD酶活性在第2、3天和第4天高于MS云烟85-L，且第2天差异显著，第3天差异不显著，第4天差异极显著。在第4天，MS云烟85-H的SOD酶活性高于MS云烟85-L，且差异达到最大，所以可以用第4天的SOD酶活性反映种子活力。MS云烟85-H的POD酶活性在第1天低于MS云烟85-L，且差异不显著；MS云烟85-H的POD酶活性在第2、3、4天和第5天高于MS云烟85-L，且第2天差异不显著，第3、4、5天差异极显著。在第5天，MS云烟85-H的POD酶活性高于MS云烟85-L，且差异达到最大，所以可以用第5天的POD酶活性反映种子活力。

表2 不同活力烟草种子抗氧化酶活性

2.4 种子活力与抗氧化酶活性的相关性分析

为了验证CAT、SOD、POD酶是否可以作为种子活力评价的生理指标，用MS云烟85-H和MS云烟85-L的发芽率、发芽势、发芽指数分别与CAT、SOD、POD酶活性做相关性分析。结果显示(表3)，种子发芽指标与第5天的CAT酶活性和SOD酶活性呈负相关，其余都是正相关。对于CAT酶，种子发芽指标与第1、4天和第5天的酶活性复相关性系数(R2)均较高；对于SOD酶，种子发芽指标与第4天和第5天的酶活性复相关性系数均较高；对于POD酶，种子发芽指标与第3、4天和第5天的酶活性复相关性系数均较高。结合不同活力种子间抗氧化酶活力差异大小，可以选择第4天的CAT和SOD酶以及第5天的POD酶活性反映种子活力。

表3 烟草种子发芽指标与抗氧化酶活性的复相关系数

2.5 种子活力与抗氧化酶活性的线性回归分析

根据种子活力与抗氧化酶活性的相关性分析结果，选择相关性较大、抗氧化酶活性差异较大的第4天和第5天，以抗氧化酶活性为自变数，以种子发芽指标为依变数，进行线性回归分析(表4)。优选第4天的CAT和SOD酶活性以及第5天的POD酶活性反映种子活力。第4天的CAT酶活性表示种子活力的回归方程分别为：发芽率Y=0.000 798 1X+63.20，发芽势Y=0.001 048X+51.83，发芽指数Y=0.000 230 0X+9.302；第4天的SOD酶活性表示种子活力的回归方程分别为：发芽率Y=0.076 66X+77.18，发芽势Y=0.090 32X+71.97，发芽指数Y=0.021 12X+13.50；第5天的POD酶活性表示种子活力的回归方程分别为：发芽率Y=0.000 410 4X+67.58，发芽势Y=0.000 509 6X+59.20，发芽指数Y=0.000 116 0X+10.69。

表4 种子活力与抗氧化酶活性的线性回归结果

3 讨 论

干种子中ROS并不活跃，但种子开始萌发后，包括储藏物质的降解、蛋白质的合成，能量的产生，初生和次生代谢物的生物合成等一系列的代谢过程激活。线粒体、质膜上的过氧化物酶和NADPH氧化酶被认为是ROS的主要来源。有研究表明，华中五味子种子萌发过程中SOD、POD、CAT活性均在种子萌发前期最低，在裂口率增长最快时(165 d)活性最大，除POD外，SOD、CAT活性在萌发末期再次下降[11]；小麦种子在吸胀6～30 h过程中，CAT呈现先增加后下降的趋势，POD呈现先下降后缓慢升高然后再下降的趋势[14]。本研究中，烟草种子从吸胀开始到幼苗子叶完全展开，CAT和SOD酶活性先不断升高，在完成胚轴伸长和胚根突出时达到顶峰，而后下降，POD酶活性则一直升高。根据定义，狭义的萌发开始于静态干燥的种子吸水，完成于胚轴伸长和胚根突出[15]。所以，在萌发过程中，种子CAT、SOD和POD酶活性是不断升高的。

种子活力的检测主要从生理、生化、形态、物理等方面建立方法，传统的方法有TTC染色法[16]、抗冷测定法[17]、电导率测定法[18]、Q 2检测技术[19]等，近年来兴起的基于机器视觉技术[20-21]、高光谱技术[22]、电子鼻技术[23]等的检测方法。新的检测技术具有灵敏度高、检测速度快的优势，但也存在设备要求较高的缺点。对于普通的实验室，传统的方法仍是最佳的选择。抗氧化酶是一种生理生化指标，并且与种子活力紧密相关。本研究通过比较不同萌发时间及不同活力种子抗氧化酶活性差异，分析种子活力与抗氧化酶活性的相关性，结果表明，可以选用萌发第4天的CAT和SOD酶以及第5天的POD酶活性反映烟草种子活力差异。这一结论进一步丰富了烟草种子活力检测的方法，对于稳定种子质量，把控种子源头，保障烟叶生产具有重要意义。

4 结 论

活力高的种子发芽率高、发芽速度快，在发芽指标方面表现出明显的优势；从种子吸胀开始到幼苗子叶完全展开，CAT和SOD酶活性先不断升高，在完成胚轴伸长和胚根突出时达到顶峰，而后下降，POD酶活性则一直升高；可以选择萌发第4天的CAT和SOD酶以及萌发第5天的POD酶活性反映烟草种子活力。