脂氧素受体激动剂BML-111 对创伤性脑损伤大鼠NLRP3 炎症小体的影响

胡 炜，王 刚，王 沛，金海涛，刘建敏，吕建萌，党星波

（陕西省人民医院 急诊外科，陕西 西安 710000）

创伤性脑损伤（traumatic brian injury，TBI）是神经外科常见的创伤性疾病，占所有创伤死亡人数的60%［1］。TBI 可引起炎性巨噬细胞趋化及炎性因子的释放，继而导致神经元细胞死亡和神经功能缺陷［2，3］。而NLRP3 炎症小体是调节神经炎症反应的重要多蛋白复合物［4-6］。已有研究证实，NLRP3 炎症小体可通过调节炎症反应在TBI［7，8］、缺血性脑中风［9，10］、阿尔茨海默病［11］等中枢神经系统疾病中发挥作用。

BML-111 是一种被证明有效的脂氧素受体激动剂［12］。研究发现，BML-111 可通过激活脂氧素受体产生抗炎作用［12］，因此对缺血性脑中风［13］中的炎症反应具有抑制作用。但是，BML-111 可否抑制TBI 后NLRP3 炎症小体功能尚不清楚。因此，本研究拟探讨脂氧素受体激动剂BML-111 对大鼠TBI后NLRP3 炎症小体的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康清洁级雄性SD大鼠60只，体重280～340 g，购自西安交通大学医学院实验动物中心，于22～24 ℃的温房中饲养，自由进食水。本研究所有方案和操作手段已获得陕西省人民医院伦理委员会的批准。将其随机分为4 组，包括假手术组（Sham组）、创伤性脑损伤组（TBI 组）、脂氧素受体激动剂BML-111 给药组（BML-111 组）、脂氧素受体拮抗剂BOC-2 给药组（BOC-2 组），每组各15 只。采用颅脑撞击法建立TBI 模型［14］。用氯胺酮120 mg/kg 和甲苯噻嗪6 mg/kg 麻醉大鼠，将其俯卧位固定在立体定位仪上，于右侧颅骨冠状缝后尾侧2.3 mm、矢状缝旁开2.3 mm 处开一直径5 mm 的骨窗。骨窗处硬脑膜上放一与骨窗大小吻合的垫片及直径4 mm 的撞针，将20 g 重物从硬脑膜上方15 cm 处通过导管以自由落体撞击撞针，造成大鼠右侧大脑半球脑挫裂伤；Sham 组仅开骨窗但不给予撞击。TBI组、BML-111 组和BOC-2 组大鼠建立TBI 模型；术前30 min，BOC-2 组 腹 腔 注 射50 μg/kg 的BOC-2［15，16］（溶 于0.2 mL 生 理 盐 水），Sham 组、TBI 组 和BML-111 组腹腔注射0.2 mL 生理盐水；脑创伤后即刻和脑创伤后24 h，BML-111 组和BOC-2 组腹腔注 射1 mg/kg 的BML-111［13］（溶 于0.2 mL 生 理 盐水），Sham 组和TBI 组腹腔注射0.2 mL 生理盐水。

1.2 主要试剂

BML-111 购自美国Sigma 公司，NLRP3 抗体购自美国Abcam 公司，活化Caspase-3 和总Caspase-3抗体购自美国Cell Signaling 公司，β-actin 和Caspase-1-p20 抗 体 购 自 美 国Santa Cruz 公 司，IL-1β 和IL-18 酶联免疫吸附法（ELISA）检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，TUNEL 凋亡检测试剂盒购自美国Roche 公司，BOC-2 购自Phoenix Pharmaceuticals 公司。

1.3 观察指标

1.3.1 神经功能评分 脑创伤后3 d 和7 d 行脑创伤后神经损伤评分（neurological severity score，NSS）［2］，其中包括反射实验、警觉性实验、协调性实验和运动能力实验，最大为18 分，分数越高说明颅脑损伤越重。

1.3.2 Western blot 检测及ELISA 检测 脑创伤后3 d 和7 d，各组取5 只大鼠，腹腔注射致死剂量的戊巴比妥钠（80 mg/kg）处死，快速解剖并分离右侧脑皮质损伤中心周围5 mm 区域。加入RIPA 裂解液充分匀浆，将其等分为两份：一份用蛋白提取试剂盒提取蛋白检测NLRP3、Caspase-1-p20、活化Caspase-3 的蛋白表达，一份用ELISA 试剂盒检测IL-1β 和IL-18 的蛋白含量（ng/L）。用于Western blot检测蛋白样本变性后，聚丙烯酰胺凝胶电泳后电转至0.45 μm 孔径的PVDF 膜上。5%的脱脂牛奶中室温封闭后，加入一抗（NLRP3 抗体，1∶1 000；Caspase-1-p20 抗体，1∶400；活化Caspase-3 抗体，1∶400；β-actin抗体，1∶500；总Caspase-3抗体，1∶1 000）4 ℃孵育过夜。加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的生物二抗室温反应2 h，后行ECL 显影并拍照。用Quantity One 软件行图像分析。NLRP3 和Caspase-1-p20 蛋白水平以目标蛋白灰度值/β-actin 灰度值表示，活化Caspase-3 蛋白水平以目标蛋白灰度值/总Caspase-3 灰度值表示。

1.3.3 TUNEL法凋亡检测 脑创伤后3 d和7 d，各组取5 只大鼠，腹腔注射致死剂量的戊巴比妥钠（80 mg/kg）处死，并用4 ℃4%多聚甲醛心内灌注。将包含挫伤区域（Sham 组选取骨窗周围区域）的冠状切块包埋在石蜡中，做5 μm 的连续切片。用0.1%Triton X-100 透化2 min，封闭30 min 后，根据厂商的说明书使用行TUNEL 染色，并用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）行核复染。荧光显微镜400×倍镜下观察损伤侧大脑皮层并摄片，DAPI 染色细胞核呈蓝色荧光，TUNEL 阳性细胞核呈绿色荧光。

1.4 统计学处理

应用SPSS 13.0 统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示。组间及组内比较采用单因素方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组大鼠脑创伤后脑含水率和NSS评分的比较

与Sham 组 比 较，TBI 组 脑 含 水 率 及NSS 评 分在脑创伤后3 d 和7 d 均明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与TBI 组比较，BML-111 组脑含水率及NSS 评分在脑创伤后3 d 和7 d 均显著减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与BML-111 组比较，BOC-2组脑含水率及NSS评分在脑创伤后3 d和7 d 均明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 4组大鼠脑创伤后脑含水率和NSS评分的比较（n=5，±s）Tab 1 Comparison of brain water content and NSS scores of the four groups at different time after brain trauma（n=5，±s）

表1 4组大鼠脑创伤后脑含水率和NSS评分的比较（n=5，±s）Tab 1 Comparison of brain water content and NSS scores of the four groups at different time after brain trauma（n=5，±s）

注：NSS：神经损伤评分；Sham 组：假手术组；TBI 组：创伤性脑损伤组；BML-111 组：BML-111 给药组；BOC-2 组：脂氧素受体拮抗剂BOC-2 给药组；与Sham 组比较，aP＜0.05；与TBI 组比较，bP＜0.05；与BML-111 组比较，cP＜0.05。

组别含水率（%）NSS 评分3 d 0 11.8±0.9a 9.3±0.5ab 11.9±1.1ac 288.2＜0.001 7 d 0 8.5±1.2a 5.4±0.3ab 9.7±1.0ac 149.9＜0.001 Sham 组TBI 组BML-111 组BOC-2 组F P 71.885±2.420 87.117±3.151a 79.199±5.520ab 85.446±2.246ac 18.65＜0.001

2.2 4 组大鼠脑创伤后不同时间点脑皮层NLRP3和Caspase-1-p20 蛋白表达的比较

与Sham 组比较，脑创伤后3 d 和7 d，TBI 组脑皮层NLRP3 和Caspase-1-p20 蛋白表达均明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与TBI 组比较，脑创伤后3 d 和7 d，BML-111 组脑皮层NLRP3和Caspase-1-p20 蛋白表达均显著减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与BML-111 组比较，脑创伤后3 d 和7 d，BOC-2 组 脑 皮 层NLRP3 和Caspase-1-p20 蛋白表达均明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2 和图1。

图1 4 组大鼠脑创伤后不同时间点脑NLRP3、Caspase-1-p20、活化Caspase-3 蛋白表达的比较Fig 1 Comparison of the protein expression of NLRP3，Caspase-1-p20，and activated Caspase-3 in the brain of the four groups at different time points after brain trauma

表2 4 组大鼠脑创伤后不同时间点脑皮层NLRP3 和Caspase-1-p20 蛋白表达的比较（n=5，±s）Tab 2 Comparison of the protein expression of NLRP3 and Caspase-1-p20 in the brain of the four groups at different time after brain trauma（n=5，±s）

表2 4 组大鼠脑创伤后不同时间点脑皮层NLRP3 和Caspase-1-p20 蛋白表达的比较（n=5，±s）Tab 2 Comparison of the protein expression of NLRP3 and Caspase-1-p20 in the brain of the four groups at different time after brain trauma（n=5，±s）

注：Sham 组：假手术组；TBI 组：创伤性脑损伤组；BML-111 组：BML-111 给药组；BOC-2 组：脂氧素受体拮抗剂BOC-2 给药组。与Sham 组比较，aP＜0.05；与TBI 组比较，bP＜0.05；与BML-111 组比较，cP＜0.05。

组别Sham 组TBI 组BML-111 组BOC-2 组NLRP3 7 d 0.282±0.035 0.693±0.044a 0.382±0.045ab 0.634±0.097ac 63.29＜0.001 Caspase-1-p20 3 d 0.149±0.010 0.459±0.081a 0.259±0.023ab 0.405±0.071ac 38.73＜0.001 7 d 0.168±0.021 0.484±0.076a 0.218±0.027ab 0.455±0.052ac 64.65＜0.001 FP 3 d 0.296±0.044 0.664±0.088a 0.434±0.043ab 0.616±0.088ac 36.12＜0.001

2.3 4 组大鼠脑创伤后不同时间点脑IL-1β 和IL-18蛋白含量的比较

与Sham 组比较，脑创伤后3 d 和7 d，TBI 组脑皮层IL-1β 和IL-18 蛋白含量均明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与TBI 组比较，脑创伤后3 d和7 d，BML-111 组 脑 皮 层IL-1β 和IL-18 蛋 白 含 量均显著减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与BML-111 组比 较，脑创伤后3 d 和7 d，BOC-2 组脑皮层IL-1β 和IL-18 蛋白含量均明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 4 组大鼠脑创伤后不同时间点脑皮层IL-1β 和IL-18 蛋白含量的比较（ng/mL，n=5，±s）Tab 3 Comparison of the content of IL-1β and IL-18 in the brain of the four groups at different time after brain trauma（n=5，±s）

表3 4 组大鼠脑创伤后不同时间点脑皮层IL-1β 和IL-18 蛋白含量的比较（ng/mL，n=5，±s）Tab 3 Comparison of the content of IL-1β and IL-18 in the brain of the four groups at different time after brain trauma（n=5，±s）

注：Sham 组：假手术组；TBI 组：创伤性脑损伤组；BML-111 组：BML-111 给药组；BOC-2 组：脂氧素受体拮抗剂BOC-2 给药组；与Sham 组比较，aP＜0.05；与TBI 组比较，bP＜0.05；与BML-111 组比较，cP＜0.05。

组别IL-1β IL-18 7 d 33.0±5.2 84.9±9.8a 43.4±7.5ab 82.4±9.1ac 65.01＜0.001 Sham 组TBI 组BML-111 组BOC-2 组F P 3 d 50.0±3.2 119.6±17.5a 71.4±10.9ab 110.5±13.6ac 41.76＜0.001 7 d 54.9±6.5 137.6±20.1a 75.0±10.6ab 141.1±18.5ac 51.08＜0.001 3 d 27.6±6.2 86.8±8.1a 43.8±7.3ab 81.5±15.7ac 49.43＜0.001

2.4 4 组大鼠脑创伤后不同时间点脑皮层TUNEL阳性细胞数和活化Caspase-3 蛋白表达的比较

与Sham 组比较，脑创伤后3 d 和7 d，TBI 组脑皮层TUNEL 阳性细胞数和活化Caspase-3 蛋白表达均明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与TBI 组 比 较，脑 创 伤 后3 d 和7 d，BML-111 组 脑 皮层TUNEL 阳性细胞数和活化Caspase-3 蛋白表达均显著减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与BML-111 组比 较，脑创伤后3 d 和7 d，BOC-2 组脑皮层TUNEL 阳性细胞数和活化Caspase-3 蛋白表达均明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表4 和图1、2。

表4 4 组大鼠脑创伤后不同时间点脑皮层TUNEL 阳性细胞数和活化Caspase-3 蛋白表达的比较（n=5，±s）Tab 4 Comparison of the number of TUNEL-positive cells and the protein expression of active Caspase-3 in the brain of the four groups at different time after brain trauma（n=5，±s）

表4 4 组大鼠脑创伤后不同时间点脑皮层TUNEL 阳性细胞数和活化Caspase-3 蛋白表达的比较（n=5，±s）Tab 4 Comparison of the number of TUNEL-positive cells and the protein expression of active Caspase-3 in the brain of the four groups at different time after brain trauma（n=5，±s）

注：Sham 组：假手术组；TBI 组：创伤性脑损伤组；BML-111 组：BML-111 给药组；BOC-2 组：脂氧素受体拮抗剂BOC-2 给药组；与Sham 组比较，aP＜0.05；与TBI 组比较，bP＜0.05；与BML-111 组比较，cP＜0.05。

组别TUNEL 阳性细胞（/mm2）3 d 58±21 563±77a 318±43ab 620±80ac 91.06＜0.001 7 d 79±28 653±98a 324±26ab 700±124ac 69.77＜0.001活化Caspase-3 3 d 0.124±0.015 0.623±0.053a 0.232±0.024ab 0.503±0.085abc 99.60＜0.001 7 d 0.114±0.021 0.608±0.121a 0.318±0.058ab 0.627±0.067ac 52.83＜0.001 Sham 组TBI 组BML-111 组BOC-2 组FP

图2 4 组大鼠脑创伤后不同时间点脑TUNEL 阳性凋亡细胞数的比较Fig 2 Comparison of the number of TUNEL-positive cells in the brain of the four groups at different time after brain trauma

3 讨论

TBI 是由机械性脑组织损伤（原发性损伤）和继发性损伤导致的［1，17］。原发性损伤一旦发生就具有不可逆性，尚缺乏有效的治疗手段。而继发性损伤具有延迟性，被认为是由多种因素共同引起的，其中包括炎症反应恶化及随后的神经元细胞凋亡［2，18］。因此，抑制神经炎症反应可能是治疗或缓解TBI 的有效手段。

脂氧素是花生四烯酸在脂氧合酶作用下生成的抗炎分子［13］。脂氧素可与其特异性受体（FPR2）结合，起到限制中性粒细胞募集、增加抗炎因子生成及促进炎性碎片清除的作用［13，19］。该受体可在中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、小胶质细胞等多种炎症相关细胞中表达［19-21］。已有研究［13］显示，静脉注射1 mg/kg 的脂氧素受体激动剂BML-111 可缓解大鼠缺血再灌注损伤所致的炎症反应。因此，参照该文献，本研究于TBI 后即刻和24 h 腹腔注射1 mg/kg 的BML-111。结果显示，该BML-111 治疗可显著减少大鼠脑含水率，降低脑创伤后3 d和7 d 的NSS 评分。此外，本研究结果还显示，BML-111 治疗可减轻TBI 后脑皮层TUNEL 阳性细胞数和凋亡标记物Caspase-3 的表达。这些结果都说明BML-111 治疗可缓解急性脑创伤所致的脑水肿、神经功能损伤及细胞凋亡。

NLRP3 炎症小体是目前研究最多的炎症小体［4］。当细胞暴露于外源性或内源性病原分子时，NLRP3 将发生激活，促使Caspase-1 前体自动切割成Caspase-1 活性片段（Caspase-1-p20）［22］。活化的Caspase-1 可 促 使 活 性IL-1β 和IL-18 分 子 生 成 并 释放。IL-1β 和IL-18 的产生会进一步与其它促炎因子（如TNF-α）产生协调作用，加剧脑外伤后的继发性损伤。因此，本研究检测了TBI 后大鼠脑NLRP3、Caspase-1-p20（NLRP3 炎症小体激活标记物）及NLRP3 炎症小体激活产物（IL-1β 和IL-18）的蛋白表达。结果显示，BML-111 治疗可抑制TBI 后脑皮层NLRP3、Caspase-1-p20、IL-1β 和IL-18 的生成，说明BML-111 治疗具有抗NLRP3 炎症小体生成的作用。为了进一步验证脂氧素受体于这种作用的相 关性，于TBI 前30 min 给予大鼠50 μg/kg 的脂氧素 受 体 拮 抗 剂BOC-2［15，16］。结 果 发 现，BOC-2 可 逆转BML-111 的抗NLRP3 炎症小体生成作用。这就提示，BML-111 的抗NLRP3 炎症小体生成作用主要是通过激活脂氧素受体所产生的。

综上所述，本研究证实了BML-111 可通过抑制NLRP3 炎症小体激活以缓解大鼠TBI 继发性脑损伤，预示了激活脂氧素受体可能是临床上治疗TBI的新策略和新思路。

作者贡献度说明：

胡炜：文章撰写和动物模型构建；王刚：ELISA 实验；王沛：免疫荧光实验；金海涛：Western blot 实验；刘建敏：动物饲养；吕建萌：实验设计及材料收集；党星波：实验设计及文章校稿。