血清雌二醇、25(OH)维生素D水平与冻融单囊胚移植临床结局关系

呼 琳 宋冰冰 郝好英 王 璐 何巧花

河南省人民医院(郑州,450003)

辅助生殖技术(ART)是治疗不孕症的主要手段，冻融囊胚移植(FBT)子宫内膜容受性较好，使子宫内膜与胚胎发育有同步性，且冻融过程中可淘汰部分发育不佳的囊胚;另外，囊胚略过胚胎基因组激活期，可一定程度去除非整体胚胎利于胚胎选择，因此，冻融单囊胚移植(SFBT)技术在辅助人类生殖领域中广泛应用，可有效改善临床妊娠率并降低多胎妊娠发生。目前研究认为[1-3]，FBT的临床妊娠结局与女性患者年龄、囊胚质量、激素、维生素D等有关[4-5]。研究发现，冻融胚胎移植(FET)后第3d雌二醇(E2)水平可预测自然周期FET的妊娠结局[6]；另外，25-OH维生素D[25(OH)D]可能通过影响子宫内膜容受性进而降低FET的妊娠率[7]。但血清E2、25(OH)D水平与SFBT临床妊娠结局的关系鲜有报道。基于此，本研究通过测定接受SFBT的女性血清E2、25(OH)D水平，分析两者与临床妊娠结局的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性收集2018年6月-2020年7月于本院接受SFBT的女性患者临床资料204例，按其临床妊娠结局分为非妊娠组和妊娠组。收集囊胚移植日内膜厚度、不孕类型、基础卵泡刺激素(bFSH)水平等资料。纳入标准：①男女双方染色体均正常；②不孕原因是男性或输卵管因素；③均行单囊胚移植；④女性月经周期均较规律。排除标准：①伴有家族性/遗传性病史；②合并高泌乳素血症、子宫肌瘤、子宫内膜异位症、子宫腺肌病、多囊卵巢综合征、甲状腺内分泌疾病；③合并子宫畸形、宫腔粘连；④有子宫畸形术、宫腔粘连分离术；⑤有不良孕产史。女性患者或家属签署知情同意书，研究符合《赫尔辛基宣言》，获得本院伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1囊胚培养不孕女性经常规促排卵后取卵，根据男方精液状况采用卵细胞质内注射单精子受精或常规体外受精。受精后第3天选1～2个胚胎用于冷冻/移植，剩余正常受精的胚胎放入G2培养液(瑞典Vitrolife公司)中囊胚培养2～3d，符合冷冻标准的囊胚采用玻璃化冷冻储存。

1.2.2囊胚冻融囊胚冷冻：将囊胚激光皱缩后放于平衡液中，室温平衡12 min，转置玻璃化冷冻液(日本KITAZATO公司)中平衡45s，将囊胚行液氮保存。囊胚复苏：囊胚移植当天将囊胚于液氮中取出，迅速置于复苏液(日本KITAZATO公司)中解冻，于培养液中冲洗数次后移入提前平衡过夜的G2囊胚培养液(瑞典Vitrolife公司)中，之后放入37℃、5% O2、6% CO2培养箱中培养2h。囊胚移植前需判断囊胚存活状况：囊胚腔重新扩张为囊胚存活。

1.2.3内膜准备、囊胚移植内膜准备：均采用自然周期内膜准备。月经周期第11天起采用B超监测卵泡，至排卵日后第1天给予常规黄体支持，第5天行囊胚移植。

1.2.4临床妊娠判定囊胚移植后第14天测定人绒毛膜促性腺激素(HCG)水平，HCG>25 mU/ml于囊胚移植后第28天B超检查，有孕囊确定为临床妊娠。

1.2.5指标检测收集女性囊胚移植后第3天空腹外周血，采用全自动化学发光免疫分析仪(美国雅培)微颗粒化学发光法测定血清E2水平，高效液相色谱-串联质谱仪(美国AB)测定血清25(OH)D水平。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 两组临床资料比较

两组年龄、不孕年限、体质指数(BMI)、子宫内膜厚度、不孕类型、bFSH水平无差异(P>0.05)。见表1。

表1 两组一般资料比较

2.2 两组血清E2、25(OH)D水平比较

妊娠组血清E2(544.92±108.63 pmol/L)、25(OH)D(65.37±16.26 nmol/L)水平均高于非妊娠组(365.73±72.57 pmol/L、41.65±10.44 nmol/L)(t=14.472、12.257， 均P<0.001)。

2.3 影响SFBT临床妊娠结局因素分析

以SFBT女性是否妊娠(否=0、是=1)为因变量，年龄、不孕年限、BMI、内膜厚度、不孕类型、bFSH、E2、25(OH)D为自变量，行logistic回归分析。结果显示，E2、25(OH)D均是影响临床妊娠结局的保护因素(P<0.05)，年龄是影响临床妊娠结局的危险因素(P<0.05)。见表2。

表2 影响SFBT临床妊娠结局因素的logistic回归分析

2.4 血清E2、25(OH)D水平对SFBT临床妊娠结局的预测价值

ROC曲线显示，血清E2预测SFBT临床妊娠结局的曲线下面积(AUC)为0.892(95%CI:0.849～0.936)，截断值为444.76 pmol/L，约登指数为0.691，其敏感度、特异性分别为89.7%、79.4%；血清25(OH)D预测SFBT临床妊娠结局的AUC为0.893(95%CI:0.849～0.937)，截断值为52.72 nmol/L，约登指数为0.672，其敏感度、特异性分别为88.7%、78.5%；两者联合预测SFBT临床妊娠结局的AUC为0.949(95%CI:0.920～0.977)，约登指数为0.811，其敏感度、特异性分别为87.6%、93.5%。

3 讨论

随着玻璃化冷冻技术出现及囊胚培养技术日渐成熟，FBT临床妊娠率显著提高，且单囊胚移植可有效降低流产率及多胎妊娠率，SFBT已被临床采用[8-9]。SFBT的临床妊娠结局可能受多方面因素影响，寻找与SFBT临床妊娠结局相关且可评估的指标，对及时干预并改变临床妊娠结局有一定参考意义。

E2是子宫内膜准备所必需物质，其影响子宫内膜转化及胚胎对子宫内膜粘附，有助于孕育囊胚，且影响黄体期呈现的第二个高峰，可提高妊娠率，与妊娠结局密切相关[10-11]。E2可有效预测早孕期妊娠结局[12]；另外，E2在非正常妊娠女性中呈低水平，对临床判定早孕结局有一定指导意义[13]。以上研究表明，血清E2水平异常可能与不良妊娠结局相关。本研究中非妊娠女性血清E2水平低于妊娠女性，提示E2可能影响SFBT的临床妊娠结局。推测，囊胚移植后第3日是孕激素分泌达到高峰、黄体成熟、E2分泌第二高峰期，而血清E2水平降低引起孕激素受体不足，导致黄体功能降低，使胚胎种植率降低[6]，影响妊娠结局，但其具体影响机制有待深入探究证实。本研究显示，血清E2预测行SFBT治疗女性临床妊娠结局的AUC为0.892，当E2<444.76 pmol/L时临床妊娠几率较小，提示E2有望成为预测SFBT临床妊娠结局的潜在指标。

维生素D可通过与其受体结合，调节子宫内膜容受性及卵巢功能，进而影响性激素产生、卵泡发育、胚胎种植过程，其缺乏可降低妊娠率甚至不孕[14-15]。25(OH)D是血液循环中维生素D的形式，可有效反映机体维生素D水平。研究发现，孕妇缺乏25(OH)D可增加妊娠合并症及不良妊娠结局发生风险，及时测定孕妇25(OH)D水平可有效预防不良妊娠结局发生[16-17]；另外，血清25(OH)D水平与体外受精-胚胎移植妊娠结局有关[18]。以上研究表明，25(OH)D水平较低可能与女性临床妊娠结局关系密切。本研究显示，非妊娠组血清25(OH)D水平低于妊娠组，提示25(OH)D可能在SFBT的妊娠过程中有重要作用。分析原因：25(OH)D水平降低，一方面，可能通过影响囊胚发育及子宫内膜容受性进而影响SFBT临床妊娠结局；另一方面，其抑制Th1细胞增殖的作用降低，使白介素-2等杀伤性细胞因子产生较多，并抑制Th2细胞产生大量白介素-4等免疫耐受细胞因子，打破Th1/Th2平衡，造成免疫紊乱，使SFBT女性临床妊娠几率较低[19]。其具体机制仍需深入探讨。本研究中，血清25(OH)D预测行SFBT治疗女性临床妊娠结局的AUC为0.893，当血清25(OH)D水平低于52.72 nmol/L时，非临床妊娠结局风险较高，提示25(OH)D对SFBT临床妊娠结局有一定预测价值。

本研究显示，E2、25(OH)D均是影响临床妊娠结局的保护因素，年龄是影响临床妊娠结局的危险因素，提示囊胚移植后第3日血清E2、25(OH)D水平降低，可能通过影响黄体功能，引发免疫紊乱，调节子宫免疫耐受性，增加SFBT女性发生非临床妊娠风险。监控囊胚移植后第3日血清E2、25(OH)D水平，确定SFBT女性年龄，可有助于及时预防非临床妊娠结局。进一步研究发现，血清E2、25(OH)D联合预测SFBT临床妊娠结局的AUC、特异性均提高，提示E2、25(OH)D联合检测有较高的临床参考价值。

综上所述，E2、25(OH)D在SFBT非妊娠女性血清中呈低水平，两者联合检测可提高对SFBT临床妊娠结局的预测效能，对评估床妊娠结局有较高价值。后续仍需扩大样本、从多角度探讨E2、25(OH)D在SFBT临床妊娠结局中的影响机制，为临床预测SFBT临床妊娠结局增加理论依据。