妊娠期糖尿病患者肠道菌群变化特征及与炎症因子、T淋巴细胞亚群关系和对妊娠结局影响

陈悦群 费华丽 夏建妹*

1.浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院(310006)；2.浙江省杭州市妇产科医院

妊娠期糖尿病(GDM)是妊娠期妇女常见并发症[1]，可导致产妇不良妊娠结局，且产妇产后发展成为2型糖尿病概率较高，胎儿成年后出现糖耐量异常与糖尿病风险增加[2]。近年来诸多研究表明，肠道菌群改变会通过参与机体代谢从而促进GDM发生[3]。而既往研究表明，炎性反应、免疫功能与GDM发生发展相关密切[4]。但有关GDM患者肠道菌群变化特征与炎症因子、T淋巴细胞亚群的关系及其对妊娠结局的影响研究较少。基于此，本研究探究GDM患者肠道菌群与炎症因子、T淋巴细胞亚群的相关性及其对妊娠结局的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年5月-2020年12月本院产科建档定期产前检查并分娩的孕妇126例为研究对象。纳入标准：①符合GDM诊断标准[5]；②单胎妊娠，妊娠24～28周；③可正常沟通，听力与理解能力正常；④临床资料完整。排除标准：①孕前糖尿病高血压；②妊娠期间有抗生素或肠道调节药物服用史；③合并消化道疾病或近1个月有腹泻史；④合并心肝肺等器官疾病； ⑤合并感染或血液系统疾病。本研究经本院伦理委员会审批，孕妇均签署知情同意书。按照孕24～28周糖耐量检测结果分为GDM组与正常组。

1.2 检测方法

1.2.1肠道菌群检测采集孕妇晨自然排出粪便置无菌干燥采便盒内送检。取送检粪便1.0g，用灭菌稀释液10倍稀释，使用相同方法稀释10倍至10-8，混匀后制成悬液。每稀释度取50μl悬液涂抹于不同培养基上，类杆菌、乳杆菌、梭菌、拟杆菌于36±1℃厌氧培养48h，肠球菌、肠杆菌、酵母菌、葡萄球菌于36±1℃厌氧培养24h，对所需菌群进行定量、定性检测。定性检测方法为培养后计数平板培养皿中菌落数，于10-3稀释度的培养液中未检出为阴性；定量检测方法为通过革兰染色镜检、生化反应于菌落形态等鉴定计数菌落，计算出同一稀释度下平均菌落数，每个标本的菌含量=平均菌落数×稀释倍数×500。具体鉴定方法为：肠球菌为染色镜检为G-杆菌、计数有明显褐色圈的所有菌落；肠杆菌染色镜检为G-杆菌、计算发酵乳糖所有菌落；拟杆菌采用API20A、G-无芽胞杆菌；乳杆菌采用触霉阴性、G+无芽胞杆菌、APICH50；双岐菌采用食品卫生微生物检验。

1.2.2血清检测抽取孕妇晨空腹静脉血离心取上清液-80℃保存。2ml静脉血加入肝素抗凝管中，酶联免疫吸附试验法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与白细胞介素-6(IL-6)水平。采用免疫荧光法检测超敏C反应蛋白(hs-CRP)、T淋巴细胞亚群(CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)水平，试剂盒均来自江苏省苏微微生物研究有限公司生产。

1.3 治疗

GDM组患者采用综合方式治疗，包含胰岛素皮下注射、适量运动与饮食控制，要求孕妇减少糖摄入，在保证胎儿正常发育同时根据患者病情注重饮食搭配、营养均衡，当血糖超出正常范围时给予注射胰岛素治疗。

1.4 观察指标

比较两组孕妇肠道菌群变化特征与炎症因子、T淋巴细胞亚群及妊娠结局差异，并进行相关性分析。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 一般资料

GDM组52例，年龄(25.4±1.8)岁(23～28岁)，体质指数(BMI)(21.6±5.3)kg/m2(16～28 kg/m2)，孕周(26.2±1.3)周(25～28周)，孕(1.3±0.3)次(1～3次)。正常组74例，年龄(25.1±1.7)岁(23～27岁)，BMI(22.1±5.0)kg/m2(17～28 kg/m2)，孕周(25.9±1.4)周(24～28周)，孕(1.3±0.3)次(1～3次)。两组比较无差异(P>0.05)。

2.2 肠道菌群分布特征

两组孕妇梭杆菌菌落数无差异(P>0.05), GDM组双歧杆菌、乳杆菌菌落数少于正常组，肠杆菌、肠球菌、拟杆菌、酵母菌菌落数高于正常组(P<0.05)。见表1。

2.3 炎性因子水平

GDM组TNF-α、IL-6、hs-CRP水平高于正常组(P<0.05)。见表2。

2.4 T淋巴细胞亚群水平

GDM组CD8+水平高于正常组，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平少于正常组(均P<0.05)。见表3。

表1 两组肠道菌群分布比较

表2 两组炎性因子水平比较

表3 两组T淋巴细胞亚群水平比较

2.5 GDM患者肠道菌群分布特征及与炎症因子、T淋巴细胞亚群关系

Spearman 相关性显示，GDM患者肠杆菌、肠球菌、拟杆菌、酵母菌与TNF-α、IL6、HsCPR、CD8+呈正相关(P<0.05)，与CD3+、CD4+、CD4+/CD8+及组别呈负相关(P<0.05)；乳杆菌、拟杆菌与TNF、IL6、HsCPR、CD8+呈负相关(P<0.05)，与CD3+、CD4+、CD4+/CD8+及组别呈正相关(P<0.05)。见表4。

表4 GDM患者肠道菌群分布特征与炎症因子、T淋巴细胞亚群的关系

2.6 妊娠结局

GDM组妊娠正常41例(78.8%)、异常11例(21.2%)，正常组妊娠正常69例(93.2%)、异常5例(6.8%)，GDM组孕妇妊娠不良总发生率多于正常组(P<0.05)。见表5。

2.7 GDM孕妇不同妊娠结局者肠道菌群分布特征

GDM组中不同妊娠结局孕妇梭杆菌菌落数无差异(P>0.05),妊娠不良孕妇双歧杆菌、乳杆菌菌落数少于妊娠正常孕妇，肠杆菌、肠球菌、拟杆菌、酵母菌菌落数高于妊娠正常孕妇(P<0.05)。见表6。

表5 两组孕妇妊娠不良结局比较[例(%)]

表6 GDM组不同妊娠结局者肠道菌群分布比较

3 讨论

肠道菌群种类有一千多种，在生物机体正常生理功能中具有营养、抗肿瘤、抗衰老、排毒、拮抗等重要作用，尤其在代谢性疾病人群中的调控作用已逐渐成为医务工作者关注重点，但研究多集中于2型糖尿病人群，GDM相关报道较少[6-7]。

机体肠道中厌氧菌占共生菌群的98%以上，是人体最重要的微生态系统。双歧杆菌与乳杆菌是肠道菌群重要的组成成员，具有抑制肠杆菌、肠球菌等生长繁殖，改善肠道酸性环境，增强机体免疫功能作用[8]。肠道内菌群平衡可组成天然屏障，抵御外来病原菌侵袭；当机体肠道双歧杆菌、乳杆菌因各种原因减少时，肠道微生态系统环境失衡[9]。在本研究中，两组孕妇在梭杆菌菌落数上无明显差异,GDM孕妇双歧杆菌、乳杆菌菌落数少于糖耐量正常孕妇，肠杆菌、肠球菌、拟杆菌、酵母菌菌落数高于糖耐量正常孕妇。提示GDM孕妇体内伴有较严重肠道菌群失调。分析原因可能为[10-11]：双歧杆菌与乳杆菌均为益生菌，具有抑制致病菌生长，降低肠道PH值的作用；肠杆菌、肠球菌是最常见致病菌，威胁机体健康；拟杆菌利于维持肠道菌群平衡，梭杆菌与肠道黏膜完整相关密切。当益生菌菌落数下降、致病菌增多时，使肠道微生态环境破坏，肠道菌群失衡，使宿主循环系统内毒素进入体内，增加胰岛细胞损伤，导致糖尿病等代谢疾病发生。

妊娠期胰岛素抵抗是GDM的发病基础，而炎性因子升高是胰岛素抵抗的直接结果[12]，主要表现为：单核巨噬细胞系统激活，促炎因子释放，发生慢性炎性反应。而GDM患者机体代谢产物增加，肠道PH值与厌氧环境发生改变，益生菌多属厌氧菌，对肠道内环境改变敏感，当肠道代谢异常时益生菌大幅减少，机体炎性表达升高，加重胰岛素抵抗，糖代谢异常更为严重。在本研究中，GDM孕妇TNF-α、IL-6、hs-CRP水平高于糖耐量正常孕妇，且肠杆菌、肠球菌、拟杆菌、酵母菌与TNF-α、IL-6、HsCPR呈正相关，乳杆菌、拟杆菌与TNF-α、IL-6、HsCPR呈负相关。

肠道菌群平衡是机体天然屏障，肠道内菌群改变会改变肠道黏膜免疫应答。正常健康个体不对正常肠道菌群诱发免疫应答，而肠道菌群改变后益生菌较少，免疫菌群紊乱影响免疫功能，打破机体免疫耐受，降低机体免疫功能[13]。本研究中，GDM组孕妇CD8+水平高于正常组，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平少于糖耐正常组，且肠杆菌、肠球菌、拟杆菌、酵母菌与CD8+呈正相关，与CD3+、CD4+、CD4+/CD8+呈负相关；乳杆菌、拟杆菌与CD8+呈负相关，与CD3+、CD4+、CD4+/CD8+呈正相关。反映出菌群失调后免疫功能的变化。

既往研究提出，GDM一定程度影响妊娠结局，增加不良妊娠发生概率[14]。在本研究中，GDM组妊娠不良总发生率多于正常组，且妊娠不良组GDM产妇双歧杆菌、乳杆菌菌落数少于妊娠正常组，肠杆菌、肠球菌、拟杆菌、酵母菌菌落数高于妊娠正常组，提示肠道菌群分布与妊娠结局有一定关系。但肠道菌群影响GDM妊娠结局不良相关机制仍不清楚，需后期深入研究。

综上所述，GDM患者存在肠道菌群失衡，且与炎症因子、T淋巴细胞亚群有一定相关性，并一定程度影响GDM患者的妊娠结局。